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1、<p>重视碳青霉烯类耐药革兰阴性杆菌的检测 孙长贵 解放军第一一七医院检验科 南京军区医学检验质量控制中心 *1解放军第一一七医院检验科 主要内容 ? 一、碳青霉烯类抗生素 ? 二、碳青霉烯类抗生素耐药机制 ? 三、产碳青霉烯酶菌株流行与分布 ? 四、实验室检测 *解放军第一一七医院检验科2 一、碳青霉烯类抗生素 ? 碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广，抗菌活性最强的-内酰 胺类抗生素，因其具有对-内酰胺酶稳定以及毒性低等特 点，已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一。 ? 其结构与青霉素类的青霉环相似，不同之处在于噻唑环上 的硫原子为碳所替代，且C2与C3之间存在不饱和双键；另
2、外，其6位羟乙基侧链为反式构象。 ? 研究证明，正是这个构型特殊的基团，使该类化合物具有 超广谱的、极强的抗菌活性，以及对-内酰胺酶高度的稳 定性。 *解放军第一一七医院检验科3 *解放军第一一七医院检验科4 药物研制公司上市年份 亚胺培南美国默沙东1985年 美罗培南日本住友，英国I-IC1995年 厄他培南 多利培南 美国默沙东 日本盐也义公司 2002年 2005年 帕尼培南 比阿培南 日本三共株式会社 Wyeth-lederle实验室 1994年 2002年 碳青霉烯类-种类 目前中国上市的碳青霉烯类 *解放军第一一七医院检验科5 国内已经上市的品种有： 亚胺培南，美洛培南，帕尼培南，
3、 法罗培南，厄他培南，比阿培南。 碳青霉烯类作用机制 ? 碳青霉烯类抗生素作用方式都是抑制胞壁粘肽 合成酶，即青霉素结合蛋白（PBPs），从而阻 碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁缺损，菌体膨 胀致使细菌胞浆渗透压改变和细胞溶解而杀灭 细菌。 *解放军第一一七医院检验科6 碳青霉烯类抗菌谱 药物 链球菌34:634-640. 亚胺培南 和美罗培 南由此进 入 美罗培南 被泵出细 胞外，但 亚胺培南 不受影响 主动泵出系统 流出通道 (OprM) 外膜 胞浆周围间隙 连接脂蛋白 (Mex A) 胞浆膜 流出泵系统 (Mex B) 膜孔蛋白 美罗培南被泵出细胞外，但亚胺培南不受影响 碳青霉烯酶 ? ?-
4、内酰胺酶家族中最重要的成员 ? Two major groups based on the hydrolytic mechanism at the active site 活性部位-丝氨酸: class A 和 D 活性部位-锌离子: class B ? 碳青霉烯酶水解青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类 16解放军第一一七医院检验科 -内酰胺酶的结构内酰胺酶的结构 丝氨酸-内酰胺酶金属-内酰胺酶 HN OC CHCH2OH H2O Zn Zn O H H 平松啓一編：耐性菌感染症的理論与実際, 1998 碳青霉烯酶分类 *解放军第一一七医院检验科18 分类 代表酶最常见细菌 Class A KP
5、C, SME, IMI, NMC, GES 肠杆菌科 (铜绿假单胞菌罕见报告) Class B (金属-?-内酰胺酶) IMP, VIM, GIM, SPM， NDM-1 铜绿假单胞菌 肠杆菌科 不动杆菌 Class D OXA23, -40, -51, -58 不动杆菌 KPC 酶 ? 位于质粒上；接合和 非接合 ? blaKPC 可水平传播 ? blaKPC 可与介导其他耐药的基因共同存在: 广谱?-内酰胺酶 超广谱?-内酰胺酶 氨基糖苷类耐药 氟喹诺酮类耐药 ? leads to extensive-drug resistance (XDR) l亚型：KPC-1KPC-12 *19解放军
6、第一一七医院检验科 NDM-1酶 ? 已有研究结果表明编码NDM-1酶基因主要位于质粒上，质 粒大小可不同（肺炎克雷伯菌180kb质粒，大肠埃希菌 140kb质粒），提示blaNDM-1基因可在菌株间转移和传播。 少数分离菌blaNDM-1基因位于染色体上。blaNDM-1基因编码 区GC含量（57%）比周围DNA序列（62%65%）低，表 明其是外源转移获得的新DNA片段。基因全长826bp。 ? NDM-1酶分子量为28kDa，等电点（pI）6.9。 *20 解放军第一一七医院检验科 三、产碳青霉烯酶菌株流行与分布 *解放军第一一七医院检验科21 碳青霉烯酶在临床菌株中流行 *解放军第一一
7、七医院检验科22 酶类细菌 KPC肠杆菌科 金属-?-内酰胺酶(IMP, VIM) 铜绿假单胞菌 OXA不动杆菌 SME粘质沙雷菌 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC) ? KPC 是A类 ?-内酰胺酶 赋予细菌对所有?-内酰胺类包括超广谱头孢菌素类和碳青霉 烯类 耐药。 ? 出现于肠杆菌科菌 最常见于肺炎克雷伯菌。1996年在美国发现，2001年报道 。 也在下列菌中发现: 产酸克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌、肠杆 菌属、大肠埃希菌、沙门菌和沙雷菌。 ? 在铜绿假单胞菌中也有报道(南美) *23解放军第一一七医院检验科 产KPC肺炎克雷伯菌敏感谱 抗菌药物结果解释抗菌药物结果解释 阿米卡星I氯霉素R
8、阿莫西林/clavR环丙沙星R 氨苄西林R厄他培南R 氨曲南R庆大霉素R 头孢唑啉R亚胺培南R 头孢泊肟R美罗培南R 头孢噻肟R哌拉西林/TazoR 头孢替坦R妥布霉素R 头孢西丁R复方新诺明R 头孢他啶R多粘菌素BMIC 4mg/ml 头孢曲松R黏菌素MIC 4mg/ml 头孢吡肟R替甲环素S 美国产KPC菌株地理分布 经常发生 散发的 *25解放军第一一七医院检验科 美国以外KPC分布 ? 法国 (Nass et al. 2005. AAC 49:4423-4424) ? 新加坡 (report from survey) ? 波多黎各 (ICAAC 2007) ? 哥伦比亚 (Villeg
9、as et al. 2006. AAC 50:2880-2882 also positive when other carbapenemases are present 100% specificity Procedure described by Lee et al. CMI, 7, 88-102. 2001. *36解放军第一一七医院检验科 Modified Hodge Test Lawn of E. coli ATCC 25922 1:10 dilution of a 0.5 McFarland suspension Imipenem disk Test isolates Describ
10、ed by Lee et al. CMI, 7, 88-102. 2001.37 解放军第一一七医院检验科 38 双纸片协同试验金属酶 *39 解放军第一一七医院检验科 双纸片增效试验 *40 解放军第一一七医院检验科 KPC 、NDM-1等酶产生菌最终确定 ? PCR 检测耐药基因 确认方法 41 *解放军第一一七医院检验科42 *解放军第一一七医院检验科43 测序结果判读 *44 ? 测序彩图：峰体清晰、无套峰 序列比对 *解放军第一一七医院检验科45 测序结果经BLAST与基因数据为中已知序列比对分析 ，最终确定基因型。 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccor
11、e 产KPC 菌株治疗 ? 替加环素 (100.0% 有效) ? 黏菌素 (88.1% 有效) » SENTRY report. AAC. 2008. Feb;52(2):570-3 ? 米诺环素 ? 根据药敏试验选择 46 解放军第一一七医院检验科 新德里金属-ß-内酰胺酶（NDM-1) *47解放军第一一七医院检验科 First reported in 2009 from patient who traveled to India ? Additional 183 isolates reported in 2010 ? from India, Pakis
12、tan, U.K., and U.S. ? - K. pneumoniae, E. coli, Enterobacter, Proteus, Citrobacter ? NDM-1 carried on plasmids of various sizes ? Yong, AAC 53:5046, 2009; Kumarasamy, Lancet 3099, 2010; Patel, 2010 NDM-1 ? 实验室检测： ? 常规药敏试验方法 ? 分子生物学方法 *48解放军第一一七医院检验科 NDM-1 基因确证 ? 采用blaNDM-1基因特异引物进行PCR扩增及产物测序，确定 菌株是否携
13、带blaNDM-1基因。 l 引物一： 上游5-ACCGCC TGG ACC GATGACCA-3 下游5-GCCAAAGTTGGGCGC GGTTG-3 l 引物二： 上游5-GGCGGAATGGCTCATCACGA-3 下游5-CGCAACACAGCCTGACTTTC-3 *49 解放军第一一七医院检验科 * 引物引物序列（5 3） 产物大小 （bp） 退火温度 () 引物1 17U-191CAGCACACTTCCTATCTC 29255 17L-465CCGCAACCATCCCCTCTT 引物2 F-58GGCGGAATGGCTCATCACGA 28660 R-344CGCAACACAG
14、CCTGACTTTC NDM-1 解放军第一一七医院检验科 *51 解放军第一一七医院检验科 NDM-1 ?PCR阳性结果：携带NDM-1基因 ?最终确认：序列测定 ?测序公司，当天得到结果 ?测序样品：100 l以上PCR产物 ?引物及其浓度：上下游引物各10 l（20uM） ?测序要求：双向、通测，提供拼接好的序列 *52 解放军第一一七医院检验科 序列比对 ? 下载参考序列： Genbank：FN396876.1 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/255031061 AB571289、HQ171206、HM853678 ? 将测定序列与参考序列比对： 常用软件：Clustal、DNAstar、Mega ? 最终确认是否为NDM-1基因序列 ? 判定该细菌携带NDM-1基因 *53 解放军第一一七医院检验科 检测细菌耐药性有助于控制医院获得性感染的传播 解放军第一一七医院检验科 Thank you e-mail: suncgui 网络U盘： *55 解放军第一一七医院检验科 </p>
