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1、实验一 组织和白细胞中基因组DNA的提取一、 目的掌握真核生物基因组DNA的提取方法。二、 原理高产量和高纯度的真核生物DNA分离技术是进行PCR、Southern杂交、DNA文库构建，及许多其它分子生物学研究的前提条件。真核生物基因组DNA位于细胞核内，与细胞核蛋白结合在一起。要提取真核细胞基因组DNA，必须去除与核酸结合的蛋白质、多糖、脂类以及RNA等生物大分子。采用组织匀浆法破碎细胞，在SDS和EDTA溶液中，以蛋白酶K消化细胞的蛋白质。该方法虽然传统、简单，但却行之有效；不仅实验操作具有相当大的灵活性，而且不需昂贵的仪器设备。其中SDS能破坏核膜使DNA释放入水溶液，还可破坏细胞膜上的
2、脂肪和蛋白质，并与蛋白质结合成复合物从而使蛋白质变性沉淀；EDTA螯合Mg2+, Ca2+等金属离子，抑制DNA酶对DNA的降解作用。这样大分子DNA在乙醇中便以絮状物析出，离心沉淀后再用70%的乙醇洗涤除盐，干燥后溶于TE或双蒸水中。以此法制备的DNA大小一般为40150kb。三、 仪器材料（一）仪器1恒温水浴锅（北京医疗设备厂，型号：BS2-I）2高速离心机（Hema，型号：TGL-16H） 3冷冻高速离心机（珠海黑马医学仪器有限公司，型号：TGL-18R）4-20冰箱（海尔集团青岛电冰柜总厂 型号：BD-198S）5液氮罐（成都液氮容器厂，型号：YDS-35-125）6匀浆器7自动制冰机
3、 (意大利SCOTSMAN公司 型号：AF-10)（二）材料 1. 动物或人的组织标本 2. 人的血液标本四、 试剂 1. DNA抽提缓冲液： 1.0 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 50 ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2.0 ml 1.0M NaCl 100ml 10% SDS 50 ml 水 298ml2液氮3蛋白酶K（20mg/ml）：0.2g蛋白酶K溶于10ml水中。工作浓度100200g/ml。4平衡酚5氯仿63M乙酸钠（pH4.8）：称取40.81g三水乙酸钠溶于80.0ml水中，用冰乙酸调节pH值至4.8，定容至100ml。7预冷的100%乙醇8
4、预冷的70%乙醇9. 预冷的0.01M的PBS五、方法 (一) 组织细胞基因组DNA的提取1. 取新鲜组织或冰冻组织块0.3-0.5cm3，尽量剪碎，加DNA抽提缓冲液400l，在组织匀浆器中匀浆至不见组织块，转入1.5ml Ep管中，用100l DNA抽提缓冲液冲洗匀浆器，冲洗液一并转入Ep管中。2. 加入蛋白酶K至终浓度100-200g/ml，混匀后放于37水浴5-12h，中间振摇数次。3. 加500l（等体积）平衡酚，颠倒混匀30s，10,000rpm离心1min，小心取出上层水相450l，移入一新的Ep管，必要时重复抽提一次。4. 向水相管中加入500l氯仿，颠倒混匀30s，10,00
5、0rpm离心1min。5. 小心取出上层水相400l，移入另一新的Ep管，加入60l 3M NaAc（pH4.8）和1000l的冰无水乙醇，轻轻颠倒混匀，即可见或多或少的云絮状漂浮物。-20放置2h。6. 以14,000rpm冷冻离心15min，轻轻弃去上清，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀。7. 待沉淀干燥后，加适量的TE或双蒸水溶解，-20或4保存备用。 8. 取5l DNA溶液溶于495l双蒸水中，混匀，测定其在260nm和280nm处的吸光度值。 DNA含量（mg/ml）=A2605 （二）白细胞基因组DNA的提取1. 收集510ml抗凝血，3000rpm离心10min，弃去上层淡黄色的血浆
6、，小心吸取白细胞层。2. 用双蒸水洗涤白细胞，使混杂的红细胞溶血，3000rpm10min离心数次，以去除红细胞。3. 收集白细胞沉淀，以适量双蒸水或PBS重悬白细胞，移入1.5ml的离心管中，每管0.25ml。4. 加入等体积（0.25ml）的2DNA抽提缓冲液，加蛋白酶K至终浓度100200g/ml，混匀后放于37水浴25h。5. 加500l（等体积）平衡酚，颠倒混匀30s，10,000rpm离心1min，小心取出上层水相450l，移入一新的1.5ml Ep管，必要时重复抽提一次。6. 向水相管中加入500l氯仿，颠倒混匀30s，10,000rpm离心1min。7. 小心取出上层水相400
7、l，移入另一新的Ep管，加入60l 3M NaAc（pH4.8）和1000l的冰无水乙醇，轻轻颠倒混匀，即可见或多或少的云絮状漂浮物。-20放置2h。8. 以14,000rpm冷冻离心15min，轻轻弃去上清，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀。9. 待沉淀干燥后，加适量的TE或双蒸水溶解，-20或4保存备用。 10. 取5l DNA溶液溶于495l双蒸水中，混匀，测定其在260nm和280nm处的吸光度值。DNA含量（mg/ml）= A260稀释倍数/20=A2605六、结果0.5%的琼脂糖凝胶（加入溴化乙锭至终浓度0.5g/ml）电泳，即可见荧光显色的DNA条带。七、注意事项 1. 组织块取材应尽
8、量新鲜，应在尽可能剪碎后进行匀浆。所用匀浆器须配套适中，过大过小均不利于研磨组织块。 2. 蛋白酶K应尽量新鲜配制，在正式使用前应做预试验以明确其活性。 3. 在进行平衡酚、氯仿抽提时，应尽量避免吸取蛋白质，以免影响DNA的纯度。 4. DNA沉淀不能抽得太干，否则极难溶解。稍加热可促进DNA的溶解。实验二 组织和白细胞中总RNA的提取一、 目的掌握真核细胞RNA的提取技术。二、 原理细胞中的RNA有三类分子组成：rRNA（占细胞总RNA的80%85%）；tRNA和核内小分子RNA（占10%15%）；mRNA（占1%5%）。其中mRNA是分子生物学的主要研究对象。 RNA提取过程极为严格，分离
9、到高纯度和完整的RNA, 对研究基因的转录调控、基因的克隆和表达、cDNA文库的构建等均具有重要的意义。RNA分离过程中最关键的因素是尽量避免RNA酶的污染。RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性的RNA酶外，环境中也存在RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的操作环境，要尽量去除外源性RNA酶的污染、抑制内源性RNA酶的活性。外源性RNA酶的污染途径有：玻璃制品、塑料制品和电泳槽，实验操作人员的手污染等。具体对策有：所有玻璃器皿在使用前180干烤3小时以上；塑料器皿可用0.1%的DEPC浸泡或用氯仿洗涤；RNA电泳槽需用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于3% H2O
10、2溶液中，室温下放置10min，然后用0.1% DEPC处理水彻底冲洗电泳槽；全部操作过程戴一次性手套，接触可能污染了RNA酶的物品后，应及时更换手套；配制的溶液应确保无菌。常用的RNA酶抑制剂有：焦碳酸二乙酯（DEPC）。它是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应从而抑制酶的活性。因此凡不能高压灭菌的材料、器皿均可用DEPC处理，再煮沸15min或高压灭菌15min以除去残存的DEPC。异硫氰酸胍。目前被认为是最有效的抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从细胞核中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。因此从富含RNA酶
11、的组织（如胰腺等）制备RNA时，利用它可取得满意的效果。氧钒核糖核苷复合物。它是由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合后几乎能完全抑制RNA酶的活性。其使用浓度为10mM，可被酚反复抽提去除。RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）。它从人的胎盘分离得来，可以和多种RNA酶结合，使其失活。该制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用。在酚抽提的过程中应不断添加新鲜的抑制剂。其它。如SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定的抑制作用。所以制备时可采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和强力的蛋白质变性剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性的RNA酶，采用DEPC去除外源性RNA酶。具体步骤为：将细胞
12、或组织匀浆，联合使用异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、巯基乙醇抑制RNA酶，并使核蛋白复合物解离，使RNA易于进入无DNA的水相，容易被异丙醇浓缩。提取的RNA可用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻译。三、 仪器材料 1. 组织匀浆器 2. 玻璃移液管3. 微量移液器4. 吸头5. 微量离心管6. 冷冻高速离心机7. 烤箱 四、试剂 1. TRIzol试剂（GIBCO）2. 氯仿3. 异丙醇4. 75%乙醇(DEPC水配制)5. 无RNase水6. DEPC五、方法 1. 特殊处理：所用玻璃器皿经160180高温干烤6h以上，非耐高温器皿经0.1%DEPC液浸泡后，经高压（20磅15mim）处理灭
13、活RNA酶。所用试剂均用DEPC水配制后高压处理。 2. 取新鲜或冻存组织约50-100mg，剪碎，加0.8ml TRIzol试剂，匀浆，移入1.5ml离心管中，再用0.2ml TRIzol试剂冲洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，冰上静置5min。（或收获适量白细胞，移入1.5ml 离心管中，加TRIzol试剂0.8ml，混匀，冰上静置5min。） 3. 加0.2ml氯仿，充分震荡混匀，静置3min。4. 12,000g离心15min，4。（13000转/分钟）5. 小心吸取上层水相，移入另一离心管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min。6. 12,000g离心10min，4。7
14、. 弃上清，加1ml 75%乙醇充分洗涤沉淀。4，7 500g离心5min。（10000转/分钟）8. 弃上清，真空干燥10min。沉淀重悬于无RNase的水中，-70保存备用。9. 定量：取5mlRNA溶液溶于495ml的水中，混匀，测定A260和A280吸光度值 RNA含量（mg/ml）=A2604六、结果用1%甲醛变性凝胶电泳观察RNA质量：电泳槽及制胶板先用3%过氧化氢浸泡过夜；制备1%甲醛变性凝胶板：4.5ml RNA，2ml 5甲醛胶电泳缓冲液，3.5ml 37%甲醛，10ml甲酰胺，离心混匀，65变性15min后迅速置冰浴中；再加入2mlRNA上样缓冲液，离心混匀后上样，6V/cm电压，电泳1-2h；暗室内紫外光下观察，拍照；如果观察到清晰的18S、28S RNA电泳带，无大量小分子RNA，说明RNA无明显降解，可以接下述逆转录步骤，或将样本-70保存待用。 甲醛凝胶电泳及溴化乙锭染色显示：28S、18S、5S的三条主要的电泳条带。七、 注意事项1. 所有的操作都应严格在冰上进行，应戴手套。2. 玻璃器皿必须160-180干烤6h以上，不能干烤的器皿需用DEPC水浸泡高压消毒，所需液体试剂需用DEPC水配制。
