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1、第六章第六章 体外分析体外分析 深圳大学第一附属医院深圳大学第一附属医院 核医学科核医学科 申群喜申群喜 待测物质浓度与检测手段 临床化学分析 10 -12 10 -9 10 -6 10 -3 10 -0 pg/Lng/Lmg/Lmg/L g/L 免疫分析 Therapeutic Drugs Thyroid Hormone Fertility Hormone Allergy Cancer Markers Infectious Disease Vitamins Serum Proteins 常量微量 超微量 定 义: 利用放射分析方法或其派生的相关技 术,测定生物样品中微量生物活性物 质含量 检
2、测:激素 肿瘤标志物 药物浓度 受体 分 类: Click to add title in here 4 2 3 体体 外外 分分 析析 技技 术术 体外放射分析体外放射分析 体外非放射分析体外非放射分析 放射性竞争放射性竞争 结合分析结合分析 放射性非竞放射性非竞 争结合分析争结合分析 放射免疫分析放射免疫分析* * (IRMA) 免疫放射分析免疫放射分析* * 酶免疫分析酶免疫分析(EIA) (EIA) 化学发光免疫分析化学发光免疫分析 (CLIA) (CLIA) 荧光免疫分析荧光免疫分析 (FIA)(FIA) (RIA)(RIA) 胶体金标记分析胶体金标记分析 (CGIA) (CGIA)
3、 第一节第一节 放射免疫分析放射免疫分析 Radioimmunoassay, Radioimmunoassay, RIARIA Ag Ab+Ag-Ab 环环 境境 因因 素:素: 离子强度离子强度 生理盐水或缓冲液生理盐水或缓冲液 酸酸 碱碱 度度 pH6-pH9, pH7pH6-pH9, pH7左右左右 温温 度度 15 15-40 -40 ,37 ,37 最适最适 抗原抗体特异性结合反应抗原抗体特异性结合反应 一. RIA基本原理* 讨论简单化,假定的讨论简单化,假定的“ “理想模式理想模式” ”: 1. 抗原和标记抗原对抗体具有完全相同 的免疫活性 2. 抗体只有一种抗原结合位置 1+1
4、=1反应 3. 反应符合质量作用定律 Ag+Ab AgAb 一. RIA基本原理* V1 V2 AgAb Ag Ab K= 一. RIA基本原理* (一)竞争抑制免疫结合反应: 体外条件下体外条件下 过量的放射性标记抗原(*Ag) 与非标记抗原(即待测抗原,Ag)同时与限 量的特异性抗体(Ab)进行竞争抑制免疫结 合反应 (三种成份) Ag-Ab + Ag *Ag Ab+*Ag-Ab (B)(F) + Ag + *Ag(过量部分) *Ag:标记抗原 Ag:非标记抗原 Ab:特异性抗体 *Ag-Ab:标记的抗原-抗体复合物 Ag-Ab:非标记的抗原-抗体复合物 一. RIA基本原理* 一. RI
5、A基本原理* RIA原理示意图 一. RIA基本原理* (二) 剂量反应曲线/标准曲线: 定量基础: *Ag-Ab的量(因变量)与Ag的量 (自变量)之间存在竞争性抑制数量关系 函数关系:二次函数关系 用标准竞争抑制曲线(简称标准曲线)替代 一. RIA的基本原理* 标准曲线的制备 一. RIA基本原理* 标准曲线 一. RIA基本原理* 标准曲线标准曲线( (CG)CG) (三)未知样品的检测: 同等条件下 待测抗原待测抗原+过量的标记抗原过量的标记抗原 +限量的特异性抗体限量的特异性抗体 温育 分离B和F 测量放射性活度 查标准曲线求出浓度 一. RIA基本原理* 一. RIA基本原理*
6、未知样品的检测 Ag 未知样品的检测 一. RIA基本原理* 完整的试剂盒(商品化)包括: 1. 抗体 2. 标记抗原 3. 标准抗原 4. 质控品 5. 沉淀剂 二. RIA基本试剂 (一)抗体(Antibody,Ab) IgG类 “三高”: 1 亲和力 以亲和常数K表示 2 特异性 以交叉反应率表示 3 滴度 以抗体最适稀释度表示 二. RIA基本试剂 AgAb Ag Ab K= 抗体的制备: 多克隆抗体 免疫动物所得抗血清 单克隆抗体 杂交瘤技术所得抗体 二. RIA基本试剂 (二)标记抗原(* Antigen,*Ag) 抗原分子中一个或数个原子被放射性核 素所取代 标记的放射性核素有3
7、H 14C 125I等 125I 比活度高 半衰期合适(60天) 利用酪氨酸的“嗜碘性”标记 二. RIA基本试剂 (二)标记抗原(* Antigen,*Ag) 要求: 1. 同质性 2. 高放射性比活度(kBq/ug) 3. 放射化学纯度 95% 4. 免疫活性高 二. RIA基本试剂 (三)标准抗原(标准品) 高浓度的纯品物质 化学标准品 结构清楚 物理化学方法可测定 质量单位(ng/L) 生物标准品 不能用物理化学方法测定 采用与 被测物质相似分子形式的物质 生物单位(mIU/L) 要求:1. 均质性 2. 纯度高 3. 定量准确 二. RIA基本试剂 (四)待测样品 血浆 血清 体液
8、组织液 要求:符合放射性检测方法的要求 去除可能存在的干扰成份 二. RIA基本试剂 (五)检测仪器 计数仪:125I 检测射线 闪烁计数器:3H或者14C 检测射线 二. RIA基本试剂 (一)理想的分离方法: 1. 完全分离 2. 不影响反应的平衡 3. 不受外界或其它试剂的干扰 4. 操作简便 重复性好 5. 来源方便 价格低廉 三. RIA分离方法 (二)常用分离方法的比较: 分离方法 优 点 缺 点 三. RIA分离方法 分离快 适用于任何温育体 积 沉淀易于观察 便宜 组分介质及损伤组分的分析 新方法的研究和建立 分离快,适用于任何温育体 积,蛋白质含量较低的分离 介质蛋白质浓度影
9、响小,通 用,特异性高,分离完全 分离快,简易,适用于大批 样品的检测 条件不易掌握,分离不完全, 对蛋白质敏感 点样量少,不能处理大量样品 ,测定体积受限,特殊设备 对蛋白质浓度、离子强度及 PH都敏感,沉淀不稳定 二抗价格高、流程长,二次温 育可能建立新的平衡 依赖商品供应,抗体用量大, 价高,固相抗体贮存不稳定 活性炭吸附 法 电泳法 沉淀法 双抗体法 固相法 (一)误差的种类: 1. 系统误差 确定的原因 :仪器设备 试剂质量 标准曲线拟合方式等 结果:倾向性偏高或偏低 以“准确度”(accuracy)表示 2. 随机误差 难以确定的原因:放射性测量的统计 涨落 探测仪器不稳定等 结果
10、:双向性 以“精密度”(percision)表示 四. RIA质量控制 (二)精密度与准确度的区别与联系 四. RIA质量控制 甲甲 乙乙 丙丙 丁丁 甲:即准确又 乙:不准确, 丙:尚准确, 丁:即不准确 精密 但精密 但不精密 也不精密 1 零标准管结合率(B0%) 30%-50% 2 非特异性结合率(NSB%)5%-10% 3 室内质控图 制作及质控规则 四. RIA质量控制 (三)室内质量控制 (四)室间质量控制 第二节第二节 免疫放射分析免疫放射分析 ImmunoradiometricImmunoradiometric assay, assay, IRMA IRMA 一. IRMA基
11、本原理* (一)非竞争性免疫结合反应: 体外条件下体外条件下 过量的放射性标记抗体(*Ab) 与非标记抗原(Ag)进行非竞争性免疫结合 反应 (二种试剂 ) *Ab+Ag-*Ab + *AbAg (B)(F) (二) 剂量反应曲线/标准曲线: 定量基础: Ag- * Ab的量(因变量)与Ag的 量(自变量)之间存在正相关的函数关系 用标准结合曲线(简称标准曲线)替代 一. IRMA基本原理* 标准曲线的制备 一. IRMA基本原理* IRMAIRMA标准曲线的制备标准曲线的制备 一. IRMA基本原理* RIARIA标准曲线的制备标准曲线的制备 B% 标准曲线 一. IRMA基本原理* B%
12、B% IRMAIRMA的标准曲线的标准曲线 RIARIA的标准曲线的标准曲线 一. IRMA基本原理* 二. IRMA常用方法 1.双抗夹心法 (double antibody sandwich method) 1.2.标记第三抗体法(labeled third antibody method) 2.3.双标记抗体法(double labeled antibody method) 优点: l 反应动力学:非竞争性 且抗体过量 容易达到平衡 温度变 化对结果影响不大。 l 灵敏度:比RIA高出10100倍。 l 加样误差少:加样误差主要来自抗原一个环节 缺点: l 需要特殊的分离方法。 l 对半
13、抗原不适应 l 要大量的*Ab,昂贵 三. IRMA优缺点 四. IRMA与RIA主要区别* RIAIRMA 竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗原抗体结合反应 采用标记抗原采用标记抗体 三种主要反应试剂二种主要反应试剂 所用抗体是限量的所用抗体是过量的 *AgAb的量与待测Ag的量呈负相关 Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关 反应到达平衡慢反应到达平衡快 低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素 第三节第三节 非放射非放射免疫分析技术免疫分析技术 1 酶标记免疫分析技术 2 化学发光免疫分析技术 3 时间分辨荧光免疫分析技术 4 胶体金标记分析技术 一 酶标记免疫分析技术(enzyme imm
14、umoassay,EIA) 酶分子代替放射性核素 标记抗原或抗体的免疫分 析的技术 结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高 敏感性。常见方法为ELISA。 常用的酶为辣根过氧化物酶 底物是四甲基联苯胺 (TMB) ,反应后显黄色。 二 化学发光免疫分析技术(CLIA) 以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物 的超微量分析技术。 1 化学发光免疫分析 吖啶酯 2 化学发光酶免疫分析 金刚烷 3 电化学发光免疫测定 三联吡啶钌 三 时间分辨荧光免疫分析技术 (time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA ) 采用采用稀土元素稀土元素标记抗体,利用时间分辨荧光仪特标记抗体
15、,利用时间分辨荧光仪特 定的延迟时间测量,获得定的延迟时间测量,获得稀土元素稀土元素的特异荧光信号的特异荧光信号 ,同时消除非特异性荧光物质的干扰。,同时消除非特异性荧光物质的干扰。 四 胶体金标记分析技术技术 (colloidal-gold immunoassay,CGIA) 采用采用胶体金胶体金为标记物,利用氯金酸(为标记物,利用氯金酸(HAuClHAuCl 4 4 ) )在还在还 原剂的作用下,形成红色的胶体状态。原剂的作用下,形成红色的胶体状态。 问题: 放射免疫分析反应物有几种 ? 放射免疫分析抗原通常用什么标记? 免疫放射分析反应物有几种? 小结 掌握: 1.放射免疫分析的原理 、方法 及质量控制 2.免疫放射分析的原理 熟悉: 放射免疫分析质量控制 思考题: 1. 简述放射免疫分析的基本原理及方法 。 2. 如何利用RIA方法检测待测物? 3. 简述免疫放射分析的基本原理及方法 。 4. 放射免疫与免疫放射分析有何区别? 参考书: 1.核医学,第七版,李少林等主编,人卫出 版社; 2.核医学,谭天秩主编; 3.医学免疫学,第五版,金伯泉主编,人卫 出版社