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1、第六章第六章 体外分析体外分析 深圳大学第一附属医院深圳大学第一附属医院 核医学科核医学科 申群喜申群喜 待测物质浓度与检测手段 临床化学分析 10 -12 10 -9 10 -6 10 -3 10 -0 pg/Lng/Lmg/Lmg/L g/L 免疫分析 Therapeutic Drugs Thyroid Hormone Fertility Hormone Allergy Cancer Markers Infectious Disease Vitamins Serum Proteins 常量微量 超微量 定 义： 利用放射分析方法或其派生的相关技 术，测定生物样品中微量生物活性物 质含量 检
2、测：激素 肿瘤标志物 药物浓度 受体 分 类： Click to add title in here 4 2 3 体体 外外 分分 析析 技技 术术 体外放射分析体外放射分析 体外非放射分析体外非放射分析 放射性竞争放射性竞争 结合分析结合分析 放射性非竞放射性非竞 争结合分析争结合分析 放射免疫分析放射免疫分析* * (IRMA) 免疫放射分析免疫放射分析* * 酶免疫分析酶免疫分析(EIA) (EIA) 化学发光免疫分析化学发光免疫分析 (CLIA) (CLIA) 荧光免疫分析荧光免疫分析 (FIA)(FIA) (RIA)(RIA) 胶体金标记分析胶体金标记分析 (CGIA) (CGIA)
3、 第一节第一节 放射免疫分析放射免疫分析 Radioimmunoassay, Radioimmunoassay, RIARIA Ag Ab+Ag-Ab 环环 境境 因因 素：素： 离子强度离子强度 生理盐水或缓冲液生理盐水或缓冲液 酸酸 碱碱 度度 pH6-pH9, pH7pH6-pH9, pH7左右左右 温温 度度 15 15-40 -40 ,37 ,37 最适最适 抗原抗体特异性结合反应抗原抗体特异性结合反应 一. RIA基本原理* 讨论简单化，假定的讨论简单化，假定的“ “理想模式理想模式” ”： 1. 抗原和标记抗原对抗体具有完全相同 的免疫活性 2. 抗体只有一种抗原结合位置 1+1
4、=1反应 3. 反应符合质量作用定律 Ag+Ab AgAb 一. RIA基本原理* V1 V2 AgAb Ag Ab K= 一. RIA基本原理* （一）竞争抑制免疫结合反应： 体外条件下体外条件下 过量的放射性标记抗原（*Ag） 与非标记抗原（即待测抗原，Ag）同时与限 量的特异性抗体（Ab）进行竞争抑制免疫结 合反应 （三种成份） Ag-Ab + Ag *Ag Ab+*Ag-Ab (B)(F) + Ag + *Ag（过量部分） *Ag:标记抗原 Ag:非标记抗原 Ab:特异性抗体 *Ag-Ab:标记的抗原-抗体复合物 Ag-Ab:非标记的抗原-抗体复合物 一. RIA基本原理* 一. RI
5、A基本原理* RIA原理示意图 一. RIA基本原理* （二） 剂量反应曲线/标准曲线： 定量基础： *Ag-Ab的量（因变量）与Ag的量 （自变量）之间存在竞争性抑制数量关系 函数关系：二次函数关系 用标准竞争抑制曲线（简称标准曲线）替代 一. RIA的基本原理* 标准曲线的制备 一. RIA基本原理* 标准曲线 一. RIA基本原理* 标准曲线标准曲线( (CG)CG) （三）未知样品的检测: 同等条件下 待测抗原待测抗原+过量的标记抗原过量的标记抗原 +限量的特异性抗体限量的特异性抗体 温育 分离B和F 测量放射性活度 查标准曲线求出浓度 一. RIA基本原理* 一. RIA基本原理*
6、未知样品的检测 Ag 未知样品的检测 一. RIA基本原理* 完整的试剂盒（商品化）包括： 1. 抗体 2. 标记抗原 3. 标准抗原 4. 质控品 5. 沉淀剂 二. RIA基本试剂 （一）抗体（Antibody,Ab） IgG类 “三高”: 1 亲和力 以亲和常数K表示 2 特异性 以交叉反应率表示 3 滴度 以抗体最适稀释度表示 二. RIA基本试剂 AgAb Ag Ab K= 抗体的制备： 多克隆抗体 免疫动物所得抗血清 单克隆抗体 杂交瘤技术所得抗体 二. RIA基本试剂 （二）标记抗原（* Antigen,*Ag） 抗原分子中一个或数个原子被放射性核 素所取代 标记的放射性核素有3
7、H 14C 125I等 125I 比活度高 半衰期合适（60天） 利用酪氨酸的“嗜碘性”标记 二. RIA基本试剂 （二）标记抗原（* Antigen,*Ag） 要求： 1. 同质性 2. 高放射性比活度（kBq/ug) 3. 放射化学纯度 95% 4. 免疫活性高 二. RIA基本试剂 （三）标准抗原（标准品） 高浓度的纯品物质 化学标准品 结构清楚 物理化学方法可测定 质量单位(ng/L) 生物标准品 不能用物理化学方法测定 采用与 被测物质相似分子形式的物质 生物单位(mIU/L) 要求：1. 均质性 2. 纯度高 3. 定量准确 二. RIA基本试剂 （四）待测样品 血浆 血清 体液
8、组织液 要求：符合放射性检测方法的要求 去除可能存在的干扰成份 二. RIA基本试剂 （五）检测仪器 计数仪：125I 检测射线 闪烁计数器：3H或者14C 检测射线 二. RIA基本试剂 （一）理想的分离方法： 1. 完全分离 2. 不影响反应的平衡 3. 不受外界或其它试剂的干扰 4. 操作简便 重复性好 5. 来源方便 价格低廉 三. RIA分离方法 （二）常用分离方法的比较： 分离方法 优 点 缺 点 三. RIA分离方法 分离快 适用于任何温育体 积 沉淀易于观察 便宜 组分介质及损伤组分的分析 新方法的研究和建立 分离快，适用于任何温育体 积，蛋白质含量较低的分离 介质蛋白质浓度影
9、响小，通 用，特异性高，分离完全 分离快，简易，适用于大批 样品的检测 条件不易掌握，分离不完全， 对蛋白质敏感 点样量少，不能处理大量样品 ，测定体积受限，特殊设备 对蛋白质浓度、离子强度及 PH都敏感，沉淀不稳定 二抗价格高、流程长，二次温 育可能建立新的平衡 依赖商品供应，抗体用量大， 价高，固相抗体贮存不稳定 活性炭吸附 法 电泳法 沉淀法 双抗体法 固相法 （一）误差的种类： 1. 系统误差 确定的原因 :仪器设备 试剂质量 标准曲线拟合方式等 结果：倾向性偏高或偏低 以“准确度”(accuracy)表示 2. 随机误差 难以确定的原因：放射性测量的统计 涨落 探测仪器不稳定等 结果
10、：双向性 以“精密度”(percision)表示 四. RIA质量控制 （二）精密度与准确度的区别与联系 四. RIA质量控制 甲甲 乙乙 丙丙 丁丁 甲：即准确又 乙：不准确， 丙：尚准确， 丁：即不准确 精密 但精密 但不精密 也不精密 1 零标准管结合率（B0%） 30%-50% 2 非特异性结合率（NSB%）5%-10% 3 室内质控图 制作及质控规则 四. RIA质量控制 （三）室内质量控制 （四）室间质量控制 第二节第二节 免疫放射分析免疫放射分析 ImmunoradiometricImmunoradiometric assay, assay, IRMA IRMA 一. IRMA基
11、本原理* （一）非竞争性免疫结合反应： 体外条件下体外条件下 过量的放射性标记抗体（*Ab） 与非标记抗原（Ag）进行非竞争性免疫结合 反应 （二种试剂 ） *Ab+Ag-*Ab + *AbAg （B）（F） （二） 剂量反应曲线/标准曲线： 定量基础： Ag- * Ab的量（因变量）与Ag的 量（自变量）之间存在正相关的函数关系 用标准结合曲线（简称标准曲线）替代 一. IRMA基本原理* 标准曲线的制备 一. IRMA基本原理* IRMAIRMA标准曲线的制备标准曲线的制备 一. IRMA基本原理* RIARIA标准曲线的制备标准曲线的制备 B% 标准曲线 一. IRMA基本原理* B%
12、B% IRMAIRMA的标准曲线的标准曲线 RIARIA的标准曲线的标准曲线 一. IRMA基本原理* 二. IRMA常用方法 1.双抗夹心法 (double antibody sandwich method) 1.2.标记第三抗体法(labeled third antibody method) 2.3.双标记抗体法(double labeled antibody method) 优点： l 反应动力学：非竞争性 且抗体过量 容易达到平衡 温度变 化对结果影响不大。 l 灵敏度：比RIA高出10100倍。 l 加样误差少：加样误差主要来自抗原一个环节 缺点： l 需要特殊的分离方法。 l 对半
13、抗原不适应 l 要大量的*Ab，昂贵 三. IRMA优缺点 四. IRMA与RIA主要区别* RIAIRMA 竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗原抗体结合反应 采用标记抗原采用标记抗体 三种主要反应试剂二种主要反应试剂 所用抗体是限量的所用抗体是过量的 *AgAb的量与待测Ag的量呈负相关 Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关 反应到达平衡慢反应到达平衡快 低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素 第三节第三节 非放射非放射免疫分析技术免疫分析技术 1 酶标记免疫分析技术 2 化学发光免疫分析技术 3 时间分辨荧光免疫分析技术 4 胶体金标记分析技术 一 酶标记免疫分析技术（enzyme imm
14、umoassay,EIA) 酶分子代替放射性核素 标记抗原或抗体的免疫分 析的技术 结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高 敏感性。常见方法为ELISA。 常用的酶为辣根过氧化物酶 底物是四甲基联苯胺 (TMB) ，反应后显黄色。 二 化学发光免疫分析技术(CLIA) 以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物 的超微量分析技术。 1 化学发光免疫分析 吖啶酯 2 化学发光酶免疫分析 金刚烷 3 电化学发光免疫测定 三联吡啶钌 三 时间分辨荧光免疫分析技术 （time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA ） 采用采用稀土元素稀土元素标记抗体，利用时间分辨荧光仪特标记抗体
15、，利用时间分辨荧光仪特 定的延迟时间测量，获得定的延迟时间测量，获得稀土元素稀土元素的特异荧光信号的特异荧光信号 ，同时消除非特异性荧光物质的干扰。，同时消除非特异性荧光物质的干扰。 四 胶体金标记分析技术技术 （colloidal-gold immunoassay，CGIA） 采用采用胶体金胶体金为标记物，利用氯金酸（为标记物，利用氯金酸（HAuClHAuCl 4 4 ) )在还在还 原剂的作用下，形成红色的胶体状态。原剂的作用下，形成红色的胶体状态。 问题： 放射免疫分析反应物有几种 ？ 放射免疫分析抗原通常用什么标记? 免疫放射分析反应物有几种？ 小结 掌握: 1.放射免疫分析的原理 、方法 及质量控制 2.免疫放射分析的原理 熟悉: 放射免疫分析质量控制 思考题： 1. 简述放射免疫分析的基本原理及方法 。 2. 如何利用RIA方法检测待测物？ 3. 简述免疫放射分析的基本原理及方法 。 4. 放射免疫与免疫放射分析有何区别？ 参考书： 1.核医学，第七版，李少林等主编，人卫出 版社; 2.核医学，谭天秩主编； 3.医学免疫学，第五版，金伯泉主编，人卫 出版社
