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1、cDNA文库组标准流程一. Total RNA的提取1二. mRNA的分离6三cDNA双链合成8四载体制备11五. cDNA双链和载体的连接14六电转化流程15七快速鉴定、菌落PCR17八pBlueScript cDNA库扩增19一.Total RNA的提取1.试剂配制准备工作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180，烤6小时。2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1DEPC水浸泡过夜后，121 20mins高压灭菌。3、 电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水
2、处理。4、常用试剂及其配方：DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。0.78M柠檬酸纳：PH=45三水合柠檬酸纳 22.94g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。10%肌氨酸钠：肌氨酸钠 10g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 变性裂解液： 0.78M柠檬酸钠 8.25ml10%肌氨酸钠 12.375ml异硫氰酸胍 118.05g加DEPC水定容至 250ml，室温放置备用 临用前加-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v） 2M 醋酸钠 PH=4.5 NaAc3H2O 13.6g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 3M
3、醋酸钠 PH=5 NaAc3H2O 20.4g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 4M LiCL: LiCL 24.164g 加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用0.5M EDTA PH=8.0 EDTA 18.61g用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用 10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸): MOPS 41.86gNaAC3H2O 4.10g0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。 1x MOPS:10x MOPS 30ml加DEPC水270m
4、l，用时现配。4x RNA Loading buffer: 10x MOPS 400ul 甘油（高压过） 200UL 溴酚兰 10ul 甲醛(37%) 72ul 去离子甲酰氨 310ul EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul 在4 可保持3个月 10x PBSpH=7.4NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 14.4gKH2PO4 2.4g定容至 1000ml变性电泳胶：称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。变性电泳缓冲液：
5、在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml2.动物组织total RNA的提取1 根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。2 将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。3 根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。4 根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。5 冰浴10分钟。6 4C，12000g离心20分钟。7 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。蛋白质和D
6、NA分别留在了有机相和中间层。8 加入等体积的异丙醇，-20C沉淀30分钟以上。9 4C，12000g离心20分钟。10 根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。11 加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。12 4C，12000g离心20分钟。13 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20C沉淀至少30分钟。14 4C，12000g离心20分钟。15 弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4C，12000g离心10分钟。16 弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。17 取少量R
7、NA用于测定OD值及电泳，其余置80C冰箱中保存。表 1Mg# of tissue5008001000变性裂解液(ml)58102M NaOAC pH 4 (ml)0.50.81水饱和酚 (mL)5810氯仿 (mL)11.62异丙醇(mL)468变性裂解液 (mL)0.50.81异丙醇(mL)0.50.8175% 乙醇(mL)111DEPC-treated H20 (mL)0.50.813.植物组织total RNA的提取1. 先将研钵于80冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。2. 将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。（1g样品加入3ml变性裂解液）。3.
8、 加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph45）颠倒混匀。4. 加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。5. 冰浴10min。4，12000g离心10min6. 小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，70沉淀至少1小时。7. 4，12000g离心20min。8. 去上清，取沉淀。加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀（1mlLiCl/g组织），并转入1.5ml离心管中。9. 4，13000rpm离心15min。10. 用0.4ml DEPC水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。11. 4，13000rpm离心1
9、0min。12. 取上清，加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇，70沉淀30min以上。13. 4，13000rpm离心15min。14. 弃上清，用1ml 75的乙醇洗涤沉淀，4，13000rpm离心10min。15. 弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。16. 用4060ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。17. 取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置80冰箱中保存。4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)1 查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-f
10、ree离心管中，注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。2 将组织样品放入TRIzol Reagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。3室温温育10分钟 。4 据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。5 4C，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。6 转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇，-20C沉淀1小时以上。7 4C,12000g离心10分钟。8 去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。9 4C，7
11、500g离心5分钟。10 去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。11 取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置-80C冰箱中保存。表2组织量TRIzol Reagent氯仿异丙醇75%乙醇50100mg1ml0.2ml1ml1ml二.mRNA的分离1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 准备工作：1.将Oligotex Suspension 置于37水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.,然后置于室温。2.将OBB Buffer置于37水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。3.将OEB Buffer 置
12、于70水浴中，待用。试验步骤： 表3：加入试剂量据此表Total RNARNase-free Water to:Buffer OBB(ul)OligotexSuspension (ul)Prep size=0.25mg250ul250ul15Mini0.25-0.5mg500ul500ul30Midi0.5-0.75mg500ul500ul45Midi0.75-1.00mg500ul500ul55Midi1. Total RNA 量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-free water 补足到500ul2. 根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension， 轻弹1.5ml离心管彻底混匀3. 置于70水浴中3min4. 取出置于室温（2030）10min5. 13000rpm室温离心 2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。6. 用移液器取400ul OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到 Spin Column中，RT ，13000rpm，离心1min7. 将Spin Column 转移到一个新的1.5
