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1、l8n 5 05 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。本学 位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医 科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要 内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、 申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责 任。 一签锨帮聊麟丁寿牮二级学焉毳o 日 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中 特别加以标注等内容外，文中不包含其他人已发表或撰写的研究成
2、果，指 导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名：揪镭 刷磁茕嚆”口日 目录 中文摘要O OOOOO O00000OOO OOOOOOODO OOO OOOOO O1 英文摘要5 研究论文褪黑素对油酸致大鼠急性肺损伤时P 选择素和细胞间粘附 分子1 表达的影响 前言：1 0丑U 舌“”“”“”“一”“”一一”。l U 材料与方法O OOIOO OODOOO 1 1 结果D D OOr 1 5 附图O OOOOO OOOOIO OOO 0 OOO IO OO0 1 7 附表O OB Q90 3 2 讨论3 4 参考文献3 7 综述P 选择素与急性肺损伤3 9 致谢 4
3、9 个人简历5 0 中文摘要 褪黑素对油酸致大鼠急性肺损伤时P 选择素 和细胞问粘附分子1 表达的影响 摘要 目的：急性肺损伤( a c u t el u n gi n j u r y , A L l ) 是临床常见的由感染等多 种因素引起的弥漫性肺实质损伤，也是全身炎症反应综合征( s y s t e m i c i n f l a m m a t o r yr e s p o n s es y n d r o m e ，S I R S ) 或多器官功能障碍综合征( m u l t i p l e o r g a nd y s f u n c t i o ns y n d r o m e ，
4、M O D S ) 在肺部的典型表现。A L I 的发病机制 很复杂，迄今为止尚未完全阐明。以往研究证明机体尤其是肺部的氧化 抗氧化平衡失调在A L I 的发病中起主要作用，因为当肺脏受到各种致病 因素( 如创伤、休克、感染等) 的作用时，可导致肺脏局部产生剧烈的氧 化应激反应，进而引起A L I 。近来研究显示肺组织内中性粒细胞 ( p o l y m o r p h o n u c l e a rn e u t r o p h i l ，P M N ) 浸润是A L I 发病过程中的早发事 件，P M N 在肺内的“扣押”是引发损伤的关键。P M N 在肺内和或循环 血液中各种炎性刺激(
5、如L P S 、T N F 、I L I 等) 的作用下，首先扣押于肺 微血管内，继而粘附于内皮细胞并被激活，然后游出肺血管床并持续活化， 释放一系列损伤介质，引起肺泡弥漫性损害。P 选择素通常储存于内皮细 胞的分泌颗粒中，经刺激后数分钟内即动员到内皮细胞表面，主要参与介 导白细胞与内皮细胞的起始粘附。近年研究发现细胞间粘附分子1 ( I C 舢订1 ) 是介导P M N 参与肺损伤的分子生物学基础；另有研究显示， I C A M 1 可作为肺血管内皮细胞活化的标志物。因此中性粒细胞以及内皮 细胞等释放大量促炎因子、炎性介质进而引起严重反应的级联放大作用， 在A L I 的发病过程中起着重要作
6、用。如能有效控制炎症反应维持肺脏氧 化抗氧化的平衡，对于A L I 的治疗具有重要的现实意义。 丝裂原活化蛋白激酶( M A P K ) 是近年来引人注目的蛋白激酶级联通 路，其中p 3 8 M A P K 通路与炎症反应的调控密切相关。 丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nl 【i n a s e ，M A P K ) 是生 物体内重要的信号转导系统之一，是一类丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，由细 胞外信号调节激酶( e x t r a c e l l u l a rs i g n a l r e g u l a t e dh
7、n a s e ，E R K ) 、c - j u n 氨基 未端激酶( c J u n N H 2 t e r m i n a lk i n a s e ，J N K ) 、p 3 8 和E R K 5 四条级联反应 中文摘要 途径组成。每个M A P K 都有自己不同的上游激酶和特异性底物，代表了 对不同刺激引起细胞生理反应的一种普遍机制。从细胞外刺激作用于细胞 到出现相应的生物学反应，需要通过包括M A P K 、M A P K K 和M A P K K K3 个关键激酶的级联反应，按照R a s R a f ( M A P 张) M A P K K M A P K 的 顺序依次激活下游
8、激酶，最后转位到细胞核，激活转录因子E l k 、A T F 2 和A P 1 等，启动相关细胞因子和炎性介质的基因表达。这种由多个激酶 调节的级联反应，不仅使信号“瀑布”式放大，而且还通过各个激酶间的 相互作用对信号进行整合，从而保证了信号的精确性和特异性。 实验表明，p 3 8 M A P K 通路对机体有保护性作用。但由于n 盯Q 、I L 1 等持续高水平而导致的炎性过程可能与p 3 8 M A P K 的过度激活有关，尤其 在L P S 诱导的多种细胞因子合成的信号转导中起到关键性作用。B e a t y 等 实验表明p 3 8 M A P K 途径介导了L P S 作用的中性粒细胞
9、内的信号转导， p 3 8 M A P K 在L P S 作用下被磷酸化，活化的p 3 8 M A P K 即由胞浆进入胞核， 转录生成大量的炎性因子。有研究已证明抑制p 3 8 M A P K 途径，能够有效 的抑制炎症反应。褪黑素是已发现的具有强抗氧化应激作用的激素，并在 抗炎方面有积极作用，但其作用与p 3 8 M A P K 途径是否相关，国内外相关 文献报道甚少，其机制尚待研究。 褪黑素最早认为对机体的生殖系统、内分泌系统、精神神经系统和生 物节律等都有明显的调节作用，同时与睡眠、镇静等生物学行为有关。2 0 世纪9 0 年代初，T a n 等首次报道M T 具有抗氧化活性，是一种高
10、效的内源性 自由基清除剂，这将进一步扩大褪黑素在急性肺损伤方面的应用，故M T 抗A L I 机制仍然是目前的研究热点。但是，M T 抗氧化抗炎作用的信号转 导途径目前仍不十分清楚，因此从分子水平研究上述问题，为M T 的广泛 应用开辟更为广阔的前景。本实验通过静脉注射油酸复制急性肺损伤动物 模型，旨在探讨A L I 和p 3 8 M A P K 信号通路活化的关系及M T 抗A L I 的可能 机制，为M T 的临床应用提供一定的理论和实验依据。 方法：本实验采用尾静脉注射油酸( O A ) 复制大鼠急性肺损伤( A L I ) 模型，并通过腹腔给予褪黑素( M T ) 及应用p 3 8 M
11、 A P K 特异性抑制剂 S B 2 0 3 5 8 0 ，观察不同时间点肺组织病理学改变并采用免疫组化技术观察 肺组织中P 选择素( P s ) 、细胞间粘附分子1 ( I C A M 1 ) 的表达变化。 将8 4 只雄性S p r a g u e D a w l e y ( S D ) 大鼠，随机分为7 组，每组1 2 只。 中文摘要 ( 1 ) C o n t r o l 组：经尾静脉注射生理盐水( N S ) ，每只O 2m l k g ； ( 2 ) O A 组：经尾静脉注射油酸( O A ) ，每只0 2m l k g ： ( 3 ) M o A 组：经尾静脉注射油酸，每只O
12、2m l k g ，并在注射前3 0 分钟腹腔注射褪黑素( M T ) 2 0m g k g ； ( 4 ) O A + S B 2 0 3 5 8 0 ( p 3 8 M A P K 特异性抑制剂) 组：经尾静脉注射 油酸( O A ) ，每只O 2m l k g ，并在注射前3 0 分钟尾静脉注射S B 2 0 3 5 8 0 ( 5 I | m o l L ) ，每只0 2m l k g ； ( 5 ) M T + O A + S B 2 0 3 5 8 0 组：经尾静脉注射油酸( O A ) ，每只O 2m l k g ， 并在注射前3 0 分钟经腹腔注射褪黑素( M T ) 2 0m
13、 g k g 和尾静脉注射 S B 2 0 3 5 8 0 ( 5p m o l L ) ，每只O 2m l k g ： ( 6 ) M T 组：经腹腔注射褪黑素( M T ) 2 0 m g k g ； ( 7 ) S B 2 0 3 5 8 0 组：经尾静脉注射S B 2 0 3 5 8 0 ( 5g m o l L ) 0 2m l k g 。 各组动物分别于注射油酸后观察大鼠行为学改变，并在1h 、3h $ 1 6h 开胸经左心室取血后处死，同时留取肺部标本。肺部标本观察肺系数及形 态学变化，同时采用免疫组织化学染色和图像分析观察肺组织中P 选择素 ( P s ) 、细胞间粘附分子1
14、( I C A M 1 ) 的表达和分布。 数据处理利用S P S S1 1 5 统计软件进行分析，数据均以均数标准差 ( x 士s ) 来表示，组间差异用单因素方差分析( O n eW a yA N O V A ) ，有显 著差异者用S N K q 检验进行两两比较，均以P 0 0 5 为有统计学意义。 结果： l 大鼠行为学改变O A 组大鼠出现呼吸急促、精神萎靡、蜷缩成团、 毛发竖起，未见摄食。 2 肺组织形态学改变C o n t r o l 组大鼠肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺 泡腔内无渗出液；O A 组肺组织损伤严重，肺泡间隔明显增宽，肺泡腔及 肺组织间质弥漫性炎细胞浸润；应用M T 和
15、或O A + S B 2 0 3 5 8 0 肺组织损伤 较O A 组有所减轻；单纯应用M T 组或S B 2 0 3 5 8 0 大鼠肺组织结构未见异 常变化。 3 肺系数( 肺质量g 体重K g ) 各时间点O A 组大鼠肺系数明显升 高，与C o n t r o l 组比较有统计学意义( 尸 O 0 5 ) ；应用M T 和或S B 2 0 3 5 8 0 后，肺系数有所下降( 尸 o 0 5 ) ，但仍高于C o n t r o l 组，有统计学意义 ( 尸 0 0 5 ) 。 4 肺组织免疫组织化学染色 P s ：C o n t r o l 组P s 肺脏表达的阳性信号( 棕黄色) 分布于气道黏 膜上皮细胞，为胞浆阳性，且阳性信号较弱，血管内皮细胞未见表达； O A 组各时间点的阳性信号较C o n t r o l 组明显增强( 尸 O 0 5 ) ，主要分布
