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1、石墨烯材料对蛋白核小球藻的 毒性机理研究 答辩人：曹雪松 导 师：王震宇教授 2015.05.31 青岛 主要内容 u 研究背景与科学问题 u 石墨烯材料的表征 u 石墨烯材料对藻细胞的生长抑制 u 石墨烯材料对藻细胞的致毒机制 u 结论与致谢 1. 研究背景与科学问题 n 石墨烯（Graphene）是一种由碳原子以 sp2杂化轨道组成六角型呈蜂巢晶 格的二维碳纳米材料。 n 氧化石墨烯（Graphene oxide）是一种由石墨粉末经化学氧化及剥离后的 产物，是一种表面含有大量含氧官能团的石墨烯层片。 n 还原型氧化石墨烯（reduced Graphene oxide）是一种通过氧化还原法制
2、 备得到的石墨烯层片，表面含有较少量含氧官能团。 1.1 石墨烯材料简介 Graphene Graphene oxide reduced Graphene oxide Zurutuza et al., 2014, Nature nanotechnology 1.2 石墨烯材料应用 石墨烯材料是已知世上最薄、最坚硬的纳米材料，具有超 高的导电导热性能，使得石墨烯材料具有极大的应用前景 ，石墨烯材料的相关研究也成为当前研究热点 1.3 石墨烯材料可能的环境行为 石墨烯 广泛关注 1.4 石墨烯材料毒性研究现状 细菌 植物 动物人体 细胞 Begum et al., 2011, CarbonAkha
3、van et al., 2011, ACS nano Li et al., 2013, PNAS Fu et al., 2015, Biomaterials ? 藻 类 石墨烯材料 1.5 石墨烯材料对藻细胞毒性研究现状 Pretti 等研究表明石墨烯能够通过 物理损伤及氧化胁迫抑制杜氏盐藻 藻细胞生长。 Hu等研究表明石墨烯能够通过氧化胁 迫及DNA损伤抑制蛋白核小球藻藻细 胞生长。 Hu等研究表明研究表明氧化石 墨烯能够通过氧化胁迫及破坏 新陈代谢过程抑制蛋白核小球 藻藻细胞生长。 表面官能团 边缘状态 厚度 石墨烯 材料 ? 致毒机制 ? 三种石墨烯材料对藻细胞有哪些主要的毒性机 制？这
4、些毒性机制对三种石墨烯材料产生毒性 效应的贡献如何？ 三种石墨烯材料对藻细胞的毒性是否具有差异 性？哪些石墨烯性质（如表现官能团、厚度、 边缘状态等）决定其对藻细胞毒性的强弱？ 1.6 科学问题 2.1 石墨烯材料的制备 2.石墨烯材料的制备与表征 n 氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）：本实验中的氧化石墨烯采 用改进的Hummers Method，即混合浓硫酸(H2SO4)、高锰酸钾 （KMnO4）和石墨在50C水浴搅拌反应15 h，经盐酸、乙醇、蒸 馏水反复清洗，得到氧化完全的GO n 还原型氧化石墨烯（reduced Graphene oxide，rGO）：利用水合 肼在9
5、5 下还原GO得到还原完全的rGO n 多层石墨烯（ Multi-layer Graphene，G）购买于美国Graphene Supermarket G GO rGO 2.2 石墨烯材料的表征 GO rGO G X射线衍射 （XRD） l GO的层间距经计算为8.68 ，与 Marcano等利用改进Hummers Method制备 的GO层间距一致 l rGO层间距减少至3.72 ，与Park等利用水合肼还原制备rGO的层间距一致 l G层间距经计算为为3.36 ，为石墨烯标准层间距 10.2 23.9 26.5 1427 cm-1-OH l GO含有大量含氧官能团（羟基、羧基、羰基、环氧基
6、），因此GO具 有较好的亲水性和较好的悬浮性 l rGO和G表面官能团较少，因此rGO和G具有较高的疏水性，在水中 有较弱的悬浮性 3518 cm-1-OH 1757 cm-1 C=O 1639 cm-1 C=C 1238 cm-1 C-O 1130 cm-1 C-O-C 傅立叶红外光谱（FTIR） GO rGO G GO rGO G 原子力显微镜（AFM） 1.82.5 nm 0.91.2 nm 58 nm l 单层GO的厚度约为1.1 nm，表明GO约为双层氧化石墨烯 l 单层rGO的厚度约为0.56 nm，表明rGO约为双层还原型氧化石墨烯 l 单层G的厚度约为0.35 nm，表明G约为
7、18层的多层石墨烯 Graphene materials BET specific surface area (m2/g) Zeta potential in distilled water (mV) Zeta potential in medium (mV) Elemental composition C (%)O (%)H (%)S (%)N (%) GO264.6-41.91.3-27.31.339.255.22.812.79NO rGO617.6-32.71.3-24.70.762.330.12.090.195.32 G129.7-25.61.5-19.61.192.55.710.56
8、1.23NO * NO 表明该元素含量低于元素分析仪检测线 比表面积、Zeta 电位、元素组成 l rGO具有最大的比表面积，是GO的2.2倍，G的4.7倍 l GO表面带有大量负电荷，与其表面大量含氧官能团相关；三种石墨烯材料Zeta 电位在藻细胞培养液中明显降低，会降低石墨烯材料的悬浮性 l GO含氧量达到55.2%，表明GO被充分氧化；rGO含氧量降低到30.1%，表明 rGO得到充分还原 3. 石墨烯材料对藻细胞的生长抑制 实验材料 n受试生物：蛋白核小球藻（真核，25 m） n石墨烯材料： 多层石墨烯（Multi-layer graphene，G） 氧化石墨烯（Graphene ox
9、ide，GO） 还原型氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO） 多壁碳纳米管（ Multiwalled carbon nanotube，CNT） 石墨（Graphite，Gt） GO rGO G CNT Gt 3.1 不同暴露时间下，石墨烯材料对藻细胞生长的抑制 石墨烯材料及CNT、Gt（50 mg/L）暴露不同时间后，藻细胞生长的抑制率 l 随暴露时间的增加，石墨烯材料对藻细胞的抑制率逐渐增加 l 石墨烯材料对藻细胞的毒性显著强于CNT和Gt GO rGO G CNT Gt 3.2 不同暴露浓度下，石墨烯材料对藻细胞生长的抑制 l 随暴露浓度的增加石墨烯材料对藻细胞
10、的抑制率逐渐增加 l rGO、GO、G 对蛋白核小球藻的半数效应浓度 (EC50) 分别为 34.0 、37.4和62.2 mg/L 不同浓度的石墨烯材料、CNT、Gt 在暴露96 h后，对藻细胞生长的抑制率 4. 石墨烯材料对藻细胞的致毒机制 遮 蔽 效 应 损 伤 细 胞 膜 养 分 耗 竭 ROS GO treatmentControl 4.1 石墨烯材料对藻细胞的遮蔽效应 遮蔽效应装置石墨烯材料通过遮蔽效应对藻细胞生长的抑制 GO treatment 0 h GO treatment 96 h GO-藻细胞悬浮液在加入GO 96 h后的颜色变化情况 l GO能够通过遮蔽效应抑制藻细胞的
11、生长 ，rGO和G对藻细胞没有显著的遮蔽效 应 l GO 具有的良好的悬浮性及GO-藻细胞悬 浮液在96 h后明显变黑可能是GO产生遮 蔽效应的主要原因；rGO和G因容易发 生团聚沉降，是其未产生遮蔽效应的主 要原因 17% 流式细胞仪检测细胞膜完整性 l 石墨烯材料（50 mg/L）处理96 h后，藻细胞细胞膜均显著 被破坏 l石墨烯材料对细胞膜的破坏程度：rGO G GO CK rGOG GO 4.2.1 细胞膜损伤检测 膜损伤的细胞比率 4.2 石墨烯材料对藻细胞细胞膜的损伤 c a d b l 石墨烯材料（50 mg/L, 96 h）能够破坏藻细胞细胞膜，导致钾离子渗 漏，rGO能够明
12、显导致 DNA 渗漏 l 钾离子渗漏程度与流式细胞仪检测膜损伤程度相同 4.2.2 胞内物质渗漏 钾离子渗漏DNA渗漏 n 氧化胁迫 l 石墨烯材料（50 mg/L）处理96 h后，胞内ROS总量显著增加，并进一步 引起脂质过氧化 l 石墨烯材料导致氧化胁迫程度：rGO GOG 4.2.3 细胞膜损伤的原因 胞内ROS总量 脂质过氧化 A1A3 rGOrGO rGO n 物理损伤 4.2.3 细胞膜损伤的原因 G G G l SEM观察石墨烯材料处理96 h后藻细胞表面状况，rGO 和G通过锋利的尖角穿透藻细胞表面，GO未发现有穿刺 藻细胞现象 CK GO G l SEM观察石墨烯材料处理藻细
13、胞96 h 后藻细胞形态变化，GO、rGO、 G均出现细胞形态畸形的现象 CKGOrGO G nonspherocytic shriveled shriveled rGO G 4.2.3 细胞膜损伤的原因 n 物理损伤 l SEM观察石墨烯材料处理藻细胞96 h 后藻细胞形态变化，rGO、G出现 细胞开裂及部分缺失现象 4.3 石墨烯材料导致养分耗竭 n 实验方法 培养藻细胞培养藻细胞培养藻细胞 132 4.3.1 石墨烯材料引起养分耗竭程度 l 石墨烯材料会吸附培养基中的营养物质，导致养分耗竭，从而抑制藻细 胞生长，GO、rGO、G导致养分耗竭对藻细胞生长的抑制分别占它们 总毒性的53%、3
14、5%、27% l 充足的养分可以缓解石墨烯材料的毒性，表明石墨烯材料能够引起养分 耗竭，从而抑制藻细胞的生长 l 石墨烯材料导致藻细胞养分耗竭程度：GO rGO G 53% 35% 27% nMedium nSufficient nutrition medium 石墨烯材料吸附96 h后的营养液对藻细胞生长 的抑制 充足养分的营养液对石墨烯毒性的缓解 nGraphene materials nMedium after graphene materials adsorption l 石墨烯材料对微量元素（Fe、Mn、Cu、Zn）没有吸附 l 石墨烯材料明显的吸附了大量元素 (N、P、Mg、Ca)
15、 ，石墨烯材料对 大量元素的吸附是引起养分耗竭的主要原因 l 大量元素缺失程度：GO rGO G 4.3.2 石墨烯材料对营养元素的吸附 加入石墨烯材料96 h后，营养液中微量元 素的浓度变化情况 加入石墨烯材料96 h后，营养液中大量元 素的浓度变化情况 结论 l 石墨烯材料对藻细胞的毒性：rGO GO G l GO因良好的悬浮性对藻细胞产生遮蔽效应，且遮蔽效应产生的毒 性是其总毒性的17%；rGO和G因较弱的悬浮性没有产生遮蔽效应 l 石墨烯材料均能够显著破坏藻细胞细胞膜，石墨烯材料对细胞膜 的破坏程度：rGO G GO；rGO和G可以通过氧化胁迫和物理损 伤破坏藻细胞细胞膜；GO主要通过
16、氧化胁迫破坏细胞膜 l 石墨烯材料能够吸附藻细胞营养液中的营养元素（N、P、Mg、 Ca）引起养分耗竭，且养分耗竭程度：GO rGO G；GO、 rGO、G导致养分耗竭对藻细胞生长的抑制分别是它们总毒性的 53%、35%和27% 创新点创新点 首次研究了不同石墨烯材料对藻细胞的毒性差异， 揭示了石墨烯材料能够通过遮蔽效应、膜损伤、养 分耗竭等致毒机制对藻细胞产生毒性，并对不同致 毒机制在石墨烯材料对藻细胞毒性效应中的贡献进 行了定量分析 揭示了石墨烯材料会吸附藻细胞培养液中营养元素 （N、P、Mg、Ca），导致培养液养分耗竭，进而 抑制藻细胞生长 l探究石墨烯材料能否进入藻细胞，及其进入藻细胞的方式 及机理，其进入藻细胞细胞内是否能够造成基因毒性仍有 待深入研究 l如果石墨烯材料可以进入藻细胞体内，藻细胞作为水体生 态系统的初级生产者，其进入藻细胞后随食物链的迁移、 转化、富集情况尚不明确，需要进一步研究。 研究展望 致谢致谢 l 衷心感谢导师王震宇教授在人生道路
