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1、酶的分子修饰 Enzyme modification 1.1.酶分子修饰的概念 通过主链的“切割”、“剪接”和侧链基团的“化学修饰 ”,以改变其结构、性质及生物活性等.这种应用化学方法 对酶分子施行种种“手术”的技术 1.酶的分子修饰概述 或在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团(物质) ，特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改 变酶的结构和性质。 酶分子修饰的概念 生物体中存在的酶分子修饰 v酶原激活 v共价修饰 Proteolytic Zymogen Activation. 酶原激活 酶分子中的某些基团在其他酶的催化下，可共价结合或脱去 ，引起酶分子构象改变而调节其活性，此类
2、酶称为共价修饰 调节酶。 共价修饰 酶的共价修饰方式 磷酸化/去磷酸化； 乙酰化/去乙酰化； 腺苷酰化/去腺苷酰化； 尿苷酰化/去尿苷酰化； 甲基化/去甲基化； 氧化(SS)/还原(2SH)。 磷酸化/去磷酸化是是高等动植物酶化学修饰的主要形式 细菌主要是核苷酰化形式。 1.2. 酶分子修饰的目的 基础酶学的研究和疾病治疗 医疗用酶的要求 稳定性高 纯度高 无免疫原性 基础酶学研究上 (1)探测酶活性必需氨基酸的性质和数目。 (2)探测酶蛋白的结构变化与运动。 (3)测定酶蛋白部分区域的构象状态。 (4)探索酶的作用机理和催化反应历程。 (5)探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态。 (6)
3、研究酶的固定化技术。 人为地改变天然酶的一些性质,创造天然酶所不具备的某些优良特性 甚至创造出新的活性,来扩大酶的应用领域。 提高酶活性 ; 增强在不良环境(非生理条件)中的稳定性; 针对异体反应,降低生物识别能力,降低免疫原性. Low solubility Poor stability Oral delivery of proteins impossible because they are destroyed by the digestive system Injected proteins are quickly removed by renal excretion 酶应用研究上的目的
4、 2. 酶分子的修饰方法 2.1. 酶辅因子的置换修饰 2.2. 大分子结合修饰 2.3. 小分子修饰 2.4. 分子内交联 2.5. 分子间交联 2.6. 氨基酸的置换修饰 2.7. 肽链的有限水解 2.8. 物理修饰 2.1.酶辅因子的置换修饰 通过改变酶分子中的辅因子，使酶的特性和功能 发生改变，主要是金属离子的置换，因此该方法又称 为离子置换法。 主要是二价离子的置换修饰 置换修饰过程 酶液中加入EDTA透析或超滤 加入金属离子置换修饰酶 等价同荷置换 置换修饰的要点 举例 蛋白酶（Zn2）蛋白酶（Ca2），活力提高 -淀粉酶 （杂离子型）Ca2型，活力增加， 稳定性增加 2.2.大分
5、子结合修饰 v大分子的非共价修饰 v大分子的共价修饰 v大分子的非共价修饰 非蛋白质修饰物 多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺 如聚乙二醇、右旋糖苷等 能与酶非共价地相互作用而有效地保护酶，既能通 过氢键固定在酶分子表面，也能通氢键有效地与外 部水相连，通过调节酶的微环境，保护酶的活力。 有些来自嗜热菌的酶具有较高稳定性，其原因正是 由于保护性大分子(如肽和聚胺)发挥作用的结果。 酶的多聚体或酶聚合体的活力和稳定性比单体高就是 这个原因。 用抗体来稳定酶。有些抗体能在蛋白质开始伸展的部 位或被蛋白酶水解的部位起作用，因而起到稳定作用。 蛋白质类修饰物 -淀粉酶与其抗体的复合物在70半衰期为16h，
6、 而天然酶仅为5min。 抗体保护的酶还有抗氧化酶、抗有机溶剂、抗低pH 、抗自溶、抗蛋白酶等作用。 Taqase 举例 ANNEALING 37C - 65C EXTENSION 72C 25-35 CYCLES DENATURATION 93C - 95C DENATURATION 93C - 95C 优点： 抗体制备简单 任何一种酶都有它相对应的抗体，制备亦较简 单、迅速。所以，用抗体稳定酶的方法较普遍。 缺点： 制备抗体花费较多，解决的办法是用微生物来生产。最 近报告表明，已经成功地由大肠杆菌生产具有完整功能 的重组抗体片段，而且用同一种微生物既能生产目的蛋 白又生产其抗体的可能性。
7、在医学上要解决酶抗体复合物在体内的抗原性。目前 采用降低抗体分子的大小制造嵌合抗体 v大分子的共价修饰 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通 过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层 聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(SOD)，不仅可以降低或消 除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶 在体内的半衰期，从而提高了酶药效。 日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶上所 得产物溶于有机溶剂，在有机溶剂存在下能够有效地起 作用。 嗜热菌蛋白酶在水介质中通常催化肽链断裂，但用聚 乙二醇共价修饰后，其催化活性显著改变，在有机溶剂 中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。 PEG: HO-C
8、H2-CH2-(OCH2CH2)nCH2CH2-OH NH2-Prt PEG binds 2-3 water molecules per repeat unit PEG/water shield can reduce activity of protein, but generally the increased circulation time makes up for this PEGylated microspheres: Li et al. showed significant increases in circulation time by preparing controlled
9、release microparticles using PEG- PLGA block copolymers Block copolymer self-emulsifies and PEG coats both internal and external aqueous interfaces Benefit of improved protein stability within microspheres? Block copolymer localizes at aqueous/polymer interfaces Unmodified PLGA particles t1/2 = 13.6
10、 min. PEG block copolymer particles t1/2 = 270 min (4.5 hr) Altered biodistribution: high blood availability and reduced spleen/liver uptake No PLGA particles remaining in blood after 12 hrs Harris, J. M. Enz-OH, Ser221 of subtilisin; Enz-NH2, lysine residues on the surface of the enzyme; Ph, phenyl
11、. Current Opinion in Chemical Biology 1999, 3:3538 枯草杆菌蛋白酶经预处理,冻干形成交联酶晶体,在有机 溶剂和水溶液中的稳定性大大增加,活力可提高13倍 利用葡聚糖二乙醛将青霉素酰化酶进行交联,使其在 55下的半衰期提高9倍,而保持不变 2.5.分子间交联 用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂化酶 。 例如用戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。 这种杂化酶的优点是，胰凝乳蛋白酶的自溶作用降低。 2.6.氨基酸的置换修饰 化学方法 难度大，很少有使用 基因工程的方法 随机突变技术（Methods of random mutagene
12、sis） 1. chemical synthesis 2. error-prone PCR 3. DNA shuffling Mutagenesis:Why Mutate? Native proteins are not well suited for industrial application Native proteins are not optimized for medicinal purposes Increase the efficiency of enzyme-catalyzed reactions Eliminate the need for cofactor in enzy
13、matic reaction Change substrate binding site to increase specificity Change the thermal tolerance Change the pH stability Increase proteins resistance to proteases (purification) Signal sequences secretion rare codon changes 工程二硫键 增加蛋白质内部疏水性 酶表面亲水化 抗氧化失活 Asn脱酰胺失活 定点突变技术（site-directed mutagenesis) 19
14、90年Goodson将干扰素的Thr3替换为Cys3，并通过 PEG修饰，水溶性增加，半衰期延长(工程二硫键 ) 噬菌体T4溶菌酶Ile3突变为Cys3，使与Cys97形成二硫键 ，催化活性不变，但热稳定性显著提高(工程二硫键) xylanase(工程二硫键) used to treat wood pulp in paper production needs to function at high temp Glu49位于色氨酸合成酶的疏水核心部分。如Ala取代， 稳定性增加(增加蛋白质内部疏水性) Three-Dimensional Structure of T4 Lysozyme How
15、many residues can be systematically changed and retain the same fold? or what fraction of the sequence is necessary for folding? nTo assess how many residues are necessary or essential for maintaining the same fold, single and multiple alanines were inserted into three helices in T4 lysozyme. 39-50;
16、 115-123; and 126- 134. nThis type of approach is opposite to designing a protein from first principles. nWhat are the observations and conclusions? Location of new disulfide bonds in T4 lysozyme Introduction of disulfide bonds must be formed in the context of a structure. Only a limited number of locations in a protein can accept two cysteine residues in an
