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1、华中科技大学 硕士学位论文 西地那非治疗早泄作用机制的研究 姓名：朱瑜 申请学位级别：硕士 专业：药理学 指导教师：向继洲 20070501 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 III 西地那非治疗早泄作用机制的研究西地那非治疗早泄作用机制的研究 硕 士：朱 瑜 导 师：向继洲教授 中文摘要中文摘要 早泄（premature ejaculation，PE）是男子性功能障碍中仅次于男性勃起功能障 碍的最常见的症状。对早泄的治疗，目前一般采用行为疗法、局部麻醉法、三环类抗 抑郁药和选择性5羟色胺再摄取抑制剂。然而，没有一种疗效得到广泛地认
2、可。 1、2、3 国内外研究报道称4 、5、6主要用于男性勃起功能障碍治疗的选择性磷酸二酯酶 5 型抑制剂（PDE5i）西地那非（Sildenafil,Sil）对早泄的症状也有明显的改善，但是具 体机制不清楚，推测在输精管、前列腺、精囊、后尿道平滑肌上存在 5 型磷酸二酯酶 （PDE5） 。有假说认为西地那非可能通过 NO-cGMP 途径使 cGMP 水平升高，抑制输 精管收缩，使射精潜伏期延长，从而达到治疗早泄的目的。 本文从离体器官、组织、分子三个水平，探讨西地那非治疗早泄的机制，为临床 应用提供依据。 一、 西地那非对大鼠输精管的舒张作用及作用机制 本部分直接观察 Sildenafil
3、对大鼠离体输精管收缩功能的影响，并且与硝普纳 （SNP，NO 供体剂） 、左旋精氨酸（L-argine，NO 前体剂）对大鼠输精管的作用进行 了比较。进而利用一氧化氮合酶（NOS）抑制剂左旋 N-硝基精氨酸甲酯（L-NAME） 探讨 Sil 舒张输精管的途径。此外，观察了 Sil 对去甲肾上腺素（NE）引起输精管收 缩的影响。 1 在分别用 0.05Hz， 3ms， 40V 电刺激7诱导收缩和用 80mmolL 1 的高浓度 KCl8 诱导收缩的大鼠输精管标本上，以 0.1100molL 1Sil 直接作用于输精管，均可浓度 依赖性地引起舒张效应(p0.05） 。 华 中 科 技 大 学 硕
4、士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 IV 2在分别用 0.05Hz，3ms，40V 电刺激诱导收缩和用 80mmolL 1 的高浓度 KCl 诱导收缩的大鼠输精管标本上，当 NO 合酶抑制剂 L-NAME（0.1mmolL 1）存在时， 以 0.1100molL 1Sil 作用于输精管，各浓度舒张效应均减弱。电刺激收缩下 Sil 最 大舒张效应由（87.271.91 ）%降低到（68.022.29）% (p1.8）鉴定 RNA 的纯度。 1.2.2 RT-PCR 分析 每样本 2.5g 总 RNA，在 20l 的反应体系用 First Strand cDNA S
5、ynthesis Kit 逆转录合成 cDNA。取 5l 逆转录产物为模板在 50l 体系中经聚合酶链反应（PCR） 合成 DNA。 目的基因特异性上下游引物设计：PDE5A1、PDE5A2 和 -actin 分别参考见文 献和 GenBank（PDE5A1：AY155460,PDE5A2:AY155461, -actin:NM_001101） ，由上 海英骏生物技术有限公司合成，序列及大小见 Tab1。PCR 扩增条件均为：94预变 性 1min；94 30s，55 30s，72 1min，共 35 个循环；末轮循环为 72，5min。 以 -actin 为内参照。PCR 扩增产物在 1.5
6、琼脂糖凝胶电泳后，采用全自动数码成像 系统进行扫描分析各条带的光密度值， 以目的基因 PDE5A1 和 PDE5A2 与内参 -actin 的光密度值的比值作为 PDE5A1 和 PDE5A2mRAN 表达的相对量。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 16 Table1 Oligonucleotide primers used in RT-PCR for PDEs isoforms Name Sequence Use Size PDE5A-s TGA TCA CCG GGA CTT TAC CT PDE5A1 specific 34
7、5bp PDE5B-s TGC TAT GTT GCC CTT TGG AG PDE5A2 specific 327bp PDE797a GAG CAC TGG TCC CCT TCA Common downstream -actin-s TCT ACA ATG AGC TGC GTG TG Upstream primer 368bp -actin-a AAT GTC ACG CAC GAT TTC CC Downtream primer 1.3 数据处理 结果用xs 表示，t-检验进行统计分析。 2. 结结 果果 21 RT-PCR 检测大鼠输精管中 PDE5 同工酶的 mRNA 表达 提取
8、大鼠输精管平滑肌组织 mRNA，将 RT-PCR 获得的产物用凝胶电泳，在紫外 灯下分析， 每组均有 345bp、 327bp 和 368bp 三条条带， 与 PDE5A1、 PDE5A2 和 -actin 的理论扩增片段相吻合。以目的基因 PDE5A1(345bp 条带)、PDE5A2（327bp 条带)分 别与内参照 -actin（368bp 条带）的光密度比值作为 PDE5A1 和 PDE5A2 mRNA 的相 对表达量。结果表明：PDE5A1 mRNA 的相对表达量为(0.650.04)（n=5） ，PDE5A2 mRNA 的相对表达量为(0.560.03)(n=5)， 说明 PDE5
9、A1 和 PDE5A2 在大鼠输精管上均 有表达，且两种酶的表达含量无明显差异（p0.05） 。见图 7。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 17 Marker 1 2 3 4 图图 7 正常大鼠输精管上 PDE5 mRNA 表达情况 1.-actin(368bp) 2.PCR 阴性对照 3.PDE5A1(345bp) 4.PDE5A2(327bp) Marker 100-bp DNA ladder 22 西地那非对大鼠输精管中 PDE5 同工酶的 mRNA 表达的影响 加入 Sil（浴槽终浓度为 50molL-1）1.5h 和 3
10、h 后，提取大鼠输精管组织中的 mRNA。将 RT-PCR 获得的产物经 1.5%凝胶电泳，在紫外灯下分析，每组均有 345bp、 327bp 和 368bp 三条条带。对照组、Sil 孵育 1.5h 和 Sil 孵育 3h 组的 PDE5A1 mRNA 及PDE5A2 mRNA的 相 对 表 达 量 分 别 为 ： 对 照 组 (0.650.04)(PDE5A1), (0.560.03)(PDE5A2)；Sil 孵育 1.5h 组(0.520.01)(PDE5A1)，(0.480.01)(PDE5A2)； Sil 孵育 3h 组(0.440.01)(PDE5A1)，(0.360.02)(PD
11、E5A2)。可见用药后 PDE5A1 和 PDE5A2 的 mRNA 表达均比对照组减少，Sil 孵育 1.5h 组降低了 20（PDE5A1）和 15（PDE5A2） ，Sil 孵育 3h 组降低了 32（PDE5A1）和 35（PDE5A2） 。见图 8， 图 9。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 18 Sil 1.5h Sil 3h Marker 1 2 3 1 2 3 图图 8 Sil 对大鼠输精管上 PDE5A1 和 PDE5A2 表达的影响 1.PDE5A1(345bp) 2.PDE5A2(327bp) 3.-acti
12、n(368bp) Size marker is a 100-bp ladder. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 controlsil 1.5hsil 3h PDE5/Actine ratio PDE5A1 PDE5A2 图图 9 RT-PCR 测定大鼠输精管上 PDE5A1 和 PDE5A2 的表达相对量以目的基因 PDE5A1、 PDE5A2 分别与内参照 -actin 的光密度比值作为 PDE5A1 和 PDE5A2 mRNA 的相对表达量。 (n=5, :p坦索罗辛。 3.3 阴茎表面外用药阴茎表面外用药 性生活时阴茎局部性刺激积累达到一定的“阈值”
13、时，才能够激发射精。研究表明 原发型早泄患者的阴茎感觉阈值比正常对照组显著降低18， 阴茎头躯体感觉诱发电位 潜伏期较正常对照组明显缩短19， 说明早泄患者的阴茎感觉过敏或阴茎感觉神经兴奋 性增高可能是早泄的器质性原因。治疗早泄的阴茎表面外用药主要有局部表皮麻醉 药、天然植物药制剂SSCream、中药外搽剂。局麻药作用于阴茎皮肤、黏膜, 吸收 后阻滞局部末梢神经纤维的传导,从而降低其神经敏感性, 以延长射精潜伏时间。某些 天然植物药和中药不但具有对皮肤黏膜有局部麻醉作用, 可抑制阴茎头性兴奋的传导, 降低阴茎头敏感性; 且能扩张血管, 增加阴茎血流量而有助于勃起; 同时加速药物吸 收,较快地发
14、挥药效以治疗早泄。 3.3.1 局部表面麻醉药局部表面麻醉药 表面麻醉药涂布于阴茎的皮肤上以降低其敏感性可达到延迟射精的目的，最常用 的为2利多卡因乳胶。 Berkovilch等20用2 5利多卡因和2 5 丙胺卡因(prilocaine) 配成药膏(EMLA)治疗PE，取得较好的效果，方法是在性交前30 min将此药2.5g均匀地 涂布在阴茎上，用阴茎套保护以免药物被裤子擦去，敷药时间可根据患者感觉到的麻 木程度而自行调节，在性交前要用肥皂和水将药膏冲洗干净，以免引起女方阴道及外 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 29 阴麻木。E
15、MLA可使82例PE患者的射精潜伏期得以延长到52O min。夫妻双方均感 满意。在另一个早泄的对比治疗研究中, 四组早泄病人依次采用性行为疗法、单纯龟 头涂抹(性交前龟头涂抹2%丁卡因混合凝胶25 ml, 20 min后清水冲洗龟头再性交。 ) , 尿道内注入配合龟头涂抹(用上述相同的混合凝胶510ml, 尿道内注入及龟头部涂抹, 20 min后洗净龟头再性交)和综合治疗, 所有方法均由女方在性交前实施, 分别依次治 疗观察2月。 结果尿道内注入配合龟头涂抹的有效性稍低于综合疗法, 但明显高于各组 中的其他疗法; 而单纯龟头涂抹有效性明显高于性行为疗法 【21】。 3.3.2 天然植物药制剂
16、天然植物药制剂 SS-Cream SS-Cream是利用生药(九种天然植物药) 提取的有效成分, 按照严格的制剂规范 制成用于治疗早泄的一种新型阴茎表皮涂药。Xin等 【22】对53例原发性PE病人应用 SS-Cream后阴茎阈值变化研究，发现SS-Cream与安慰剂相比，明显提高阴茎阈值，且 随剂量增加，阴茎阈值亦明显增加。SS-Cream药效作用平稳持久, 且安全有效, 除轻 度局部灼热感外, 无性快感障碍或勃起障碍, 无全身不良反应。轻度局部灼热感发生 率18.49% 【23】 。 改良型SS霜(RSSC) 目前尚未应用于临床, 仍处于动物实验阶段。 Tian L 等 【24】将60只215310 kg的雄性新西兰兔, 随机分为RSSC、原SS霜(OSSC) 、安慰剂 3组,对RSSC治疗早泄的作用与OSSC进行比较评价。结果提示: RS
