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1、宁夏医科大学 硕士学位论文 血管紧张素-（1-7）对人脐静脉平滑肌细胞钙化的影响及其可 能机制 姓名：张娟 申请学位级别：硕士 专业：病理学与病理生理学 指导教师：曹军 20100401 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 中文摘要 1 血管紧张素血管紧张素-（1-7）对人脐静脉）对人脐静脉 平滑肌细胞钙化的影响及其可能机制平滑肌细胞钙化的影响及其可能机制 摘摘 要要 目的：目的： 本实验在成功复制出人脐静脉平滑肌细胞(human umbilical vein smooth muscle cells, HUSMCs)钙化模型的基础上，观察血管紧张素-(1-7)Angiotensin-(1-7),
2、Ang-(1-7)对 HUSMCs 钙沉积的影响，探索 Ang-(1-7)延缓或抑制 HUSMCs 钙沉积的可能机制。 方法：方法： 1. HUSMCs 钙化模型的复制钙化模型的复制 采用不同浓度 -甘油磷酸盐（-GP）刺激体外培养的 HUSMCs，分为 5 组（n=6） ： 对照组（CON） ，终浓度为 10mmol/L、12mmol/L、14mmol/L、16mmol/L 的 -甘油磷酸 盐组（即 10mmol/L 组、12mmol/L 组、14mmol/L 组、16mmol/L 组） 。采用 Von Kossa 染色观察 HUSMCs 钙沉积情况， 显微图像分析 Von Kossa 染色
3、钙化细胞百分比， 磷酸苯 二钠法测定细胞中碱性磷酸酶（ALP）活性，甲基百里香酚蓝法测定各组细胞中钙含量， 探寻 -GP 复制 HUSMCs 钙化模型的最佳浓度。 2.血管紧张素血管紧张素-（1-7）对）对 HUSMCs 钙化的影响钙化的影响 2.1.在成功复制 HUSMCs 钙化模型基础上，给予血管紧张素-（1-7）进行干预，分 为 6 组（n=6） ：对照组（CON） 、钙化组（CAL） 、单纯血管紧张素-（1-7）组Ang-(1-7) 组、钙化+血管紧张素-（1-7)高剂量组Ang-(1-7) H 组、钙化+血管紧张素-（1-7)中剂 量组Ang-(1-7)M 组、钙化+血管紧张素-（1
4、-7)低剂量组Ang-(1-7) L 组。 2.2.检测方法 对细胞 Von Kossa 染色、 显微图像分析、 ALP 活性和细胞钙含量等指标进行检测， 观察各组细胞钙沉积情况。 酶联免疫吸附法检测细胞培养液中 TGF1活性。 Western blot 法检测 HUSMCs 中核心结合因子 1（core binding factor 1，Cbf1） 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 中文摘要 2 蛋白表达。 放射免疫技术检测培养液中骨钙素（OC）含量，观察 HUSMCs 骨钙素变化。 结果：结果： 1. HUSMCs 钙化模型复制钙化模型复制 不同浓度 -GP 诱导体外 HUSMCs 钙化，V
5、on Kossa 染色结果显示 12mmol/L 组大 量 HUSMCs 呈菊花状聚集生长，细胞聚集处可见棕褐色钙结节，显微图像分析系统定 量计算结果发现 12mmol/L 组与 CON 组、10mmol/L 组、14mmol/L 组、16mmol/L 组相 比，钙化细胞百分比明显增加，细胞钙含量和 ALP 活性均显著升高，有显著性差异。 2.血管紧张素血管紧张素-（1-7）对）对 HUSMCs 钙化影响钙化影响 Ang-(1-7)可明显减少 HUSMCs 聚集生长， Von Kossa 染色显示细胞聚集处棕褐色 钙结节较 CAL 组明显减轻（P0.05） 。12mmol/L 组与 CON 组
6、比较细胞 ALP 活性升高 22.92%，差 异显著（P0.05） ，无显著性差异（表 7） 。 表 6 HUVSMCs 钙化细胞百分比、钙含量及 ALP 活性变化(xs,n=6) Groups Percentage of masculine cell (%) Total Ca2+ content (mmol/105cels) ALP activity (ug/105cells) CON 0.10600.05 86.542.33 1.2740.05 CAL 4.70091.35* 174.51.40* 1.86420.09* Ang(1-7) 0.21030.18 75.50.60* 1.36
7、600.17 Ang(1-7)L 1.73760.04* 151.24.00* 1.63300.02* Ang(1-7)M 1.59860.21* 146.63.10* 1.54760.08* Ang(1-7)H 1.26410.05* 133.242.60* 1.53300.02* *P70 性别比(男：女) 1:6 1:2 骨量丢失 主要为松质骨 松质骨、皮质骨 丢失速度 加速 不加速 骨折部位 椎体(粉碎性)和远端桡骨 椎体(多个锲状)髋骨 甲状旁腺 降低 增加 钙吸收 降低 减少 1，25-(OH)2D3 继发性降低 原发性降低 主要因素 绝经 年龄老化 1. 绝经后骨质疏松症绝经后骨
8、质疏松症(型骨质疏松型骨质疏松) 绝经后妇女骨质吸收速度快于骨质生成,促使骨质丢失变为疏松。绝经后约 25%妇 女患有骨质疏松症，绝经后骨质疏松的发生与雌激素下降有关28,29。雌激素具有促使骨 中钙沉积的作用，对骨骼发育和骨量维持发挥重要作用。绝经后卵巢功能减退，雌激素 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 综述 58 下降，骨失去了雌激素的保护作用，使骨重建失衡，骨吸收大于骨合成，骨丢失加速。 低骨量和骨丢失是发生骨质疏松症的决定性因素。女性骨峰值明显低于男性，绝经后骨 量丢失速度明显高于男性，因此女性较男性更易发生骨质疏松，引起骨折。 目前了解到 IL-1、IL-6、TNF-和 TGF-等为刺
9、激骨吸收的细胞因子，TGF-和 IL-4 是抑制骨吸收因子。绝经后妇女血清中白介素 1、白介素 6 和肿瘤坏死因子的水 平增高30。健康人体内雌激素调控这些细胞因子的分泌，维持正常骨的形成。一旦雌激 素水平降低，调控作用消失，血清中 IL-1、IL-6 等分泌刺激骨吸收的因子增加，使破骨 细胞增多，骨吸收增加，导致骨质疏松症。 近年来 OPG/RANK/RANKL 系统对破骨细胞形成和激活的调节具有重要作用，该 信号通路已作为治疗溶骨性疾病最重要的靶点31。临床研究显示血清 OPG 水平与绝经 后妇女的骨密度值、椎体骨折发生率呈正相关32。基础研究亦发现去卵巢大鼠术后股骨 远端 1/4 区域
10、BMD 呈下降趋势，6 周-10 周后与对照组有显著性差异，去卵巢组骨髓内 基质细胞 RANKL 蛋白表达随着去卵巢时间的延长而明显增强;去卵巢 2 周时,OPG 染色 较强,以后 OPG 染色强度逐渐降低33。提示 OPG 一过性升高可能是机体发生骨质疏松 的代偿的作用，但总体趋势不断减弱，RANKL 表达持续增强，可见 OPG/RANKL 蛋白 表达变化与绝经后骨质疏松密切相关。 2. 老年性骨质疏松老年性骨质疏松(型骨质疏松型骨质疏松) 骨成熟以后，骨组织中破骨细胞的骨吸收作用和成骨细胞的骨形成作用处于动态平 衡状态，任何导致骨吸收大于骨形成的因素均可促使骨量减少、骨质疏松发生。大量研
11、究表明有以下几种可能导致老年性 OP：随着年龄的增长，人体的骨骼及其功能都出 现不同程度的衰退和老化，老年人成骨细胞分裂增殖缓慢，骨形成因子合成代谢受阻， 破骨细胞向成骨细胞转化受抑， 骨形成期延长， 但与此同时破骨细胞处于相对活跃状态， 导致骨量减少，骨质疏松发生。随着年龄的增加，性激素分泌逐渐较少，使其对骨代 谢的调节作用减弱， 导致骨吸收与骨形成失衡， 使骨量减少。 老年人钙调激素即 PTH、 CT 和 1，25-二羟维生素 D31,25-(OH)2-D3等分泌失调，使骨转化升高，骨吸收增加， 致使骨质疏松的发生。对于老年人而言消化功能减退及光照不足，合成活性维生素 宁夏医科大学硕士研究
12、生学位论文 综述 59 D3 减少，可引起肠钙吸收减少，激发甲状旁腺素分泌亢进，作用于破骨细胞和成骨细 胞，使骨吸收大于骨形成，从而引起老年性骨质疏松症。此外，有研究显示老年性骨质 疏松患者骨量减少的同时血清中 IL-2 和 IGF-1 水平较老年正常对照人群降低，而 TNF- 明显高于老年健康对照组34，提示 IL-2、IGF-1、TNF-等细胞因子也参与了老年性 骨质疏松的发生发展过程。 三、骨质疏松症与血管钙化三、骨质疏松症与血管钙化 研究表明患有血管钙化的病人其腰椎和股骨的骨矿物质密度显著下降，并且血管疾 病的严重程度与骨量减少成正相关，提示骨质疏松症和动脉钙化之间可能存在某种联系 3
13、5。NavesM 等对 50 岁以上的西班牙人进行调查研究显示无论男女,血管钙化的发生与 骨质疏松性骨折的发生呈正相关,血管钙化的进展程度和腰椎骨矿物质密度(bone mineraL density, BMD)的下降率呈正相关36。对 72 位摩洛哥妇女进行调查结果发现：绝 经后妇女骨密度与动脉壁厚度呈负相关性，建议可用病人骨状态来评估血管疾病进程 37。充分说明血管钙化与骨质疏松症共存这一矛盾现象发生可能拥有共同的发病机制。 既往研究发现雌激素缺乏、维生素 D 和维生素 K 血症、氧化脂质、自由基生成增 多及肾脏疾病等均与血管钙化与骨质疏松的发生发展有相关性。近年来发现一些骨调节 蛋白如-羧
14、基基质谷氨酸蛋白、骨桥蛋白、骨保护素、胎球蛋白 A 和 KoLtho 蛋白和血 管紧张素和血管紧张素(1-7)等均与血管钙化与骨质疏松的发生有关。 其中骨保护素对 于血管钙化与骨质疏松的调节倍受关注，而血管紧张素和血管紧张素(1-7)对血管钙化 与骨质疏松的调节亦引起人们的注意。 目前 OPG/RANK/RANKL 系统对血管钙化与骨质疏松的影响受到广泛关注。骨保 护素(OPG)是1997年Tsuda E38等在人胚胎肺成纤维细胞IMR90的培养基里发现的可以 抑制破骨细胞形成的分泌性糖蛋白，是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，也称破骨 细胞形成抑制因子(OCIF)。OPG 具有抑制破骨细
15、胞生成、分化、活化并诱导破骨细胞凋 亡的作用，OPG 表达增多的小鼠骨质坚硬，而该基因敲除小鼠则发生骨质疏松39。OPG 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 综述 60 缺陷大鼠表现出高钙血症、主动脉及肾动脉的钙化及动脉瘤的形成，动物模型血管受累 的部位与动脉钙化患者血管钙化的部位一致40。Orita Y 等对钙化动物模型研究中发现 OPG-/-小鼠动脉发生钙化，电子显微镜观察到细胞质和血管平滑肌细胞外基质有钙沉积 现象41。Bucay N 等研究发现少年和成年 OPG-/-小鼠总骨密度减少，特征性的小梁骨和 骨皮质及颅骨顶骨等密度减少，且出现骨折高发病率，同时这些小鼠发生了大动脉和肾 动脉中层钙化42。提示 OPG 的调节信号通路或其配体在骨质疏松和动脉钙化中起到主 要作用。以上资料说明 OPG 可能是两种疾病共同发病机制的关键所在。 RANKL 即细胞核因子 B 受体活化因子配体，也称为 OPG 的配体(OPGL)。已知 RANK 是由破骨细胞前体细胞表达的一种膜结合 TNF 受体，它作为唯一的受体与 RANKL 结合，在破骨细胞分化的信号传导过程中起重要的作用43。通过 Northern bLot 分析表明 RAKNL mRNA 在骨和淋巴结中高表达
