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1、血小板生成素( T P O ) 诱导的细胞内信号途径的研究* 吴超群1高瑞兰2B e n gH t h o n 9 3 1 复旦大学生命科学院遗传所 2 浙江中医学院附属医院血研室 3 澳大利亚新南威尔士大学 【摘要】血小板生成素( T P o ) 是近年克隆的造血生长因子。们P o 通过与其受体 M P L 的结合调节细胞的增殖、分化。最初研究仅限于对血小板形成方面的作用，以 后越来越多的实验结果证明T P O 还作用于早期造血干细胞，并能诱导其体内动员 ( m o b i l i z a t i o n ) 。新近的研究还表明红一巨核白血病细胞株的T P O 受体M P L 的表 达异常增
2、高，而且大多数急性粒细胞白血病的原代细胞中T P O 受体M P L 的表迟也 异常升高。可以认为T P O 参与了正常和恶性血细胞增生的调控。但是这种调控的 机理尚不清楚，因此对T P O 诱导的造血细胞内信号途径的研究具有重要的理论和实 践意义。 在细胞丝裂原诱导的信号途径中，N F k B 族蛋白占有重要地位。研究表明N F k B 参与调控许多与细胞增殖及分化有关的基因。但是对N F k B 在造血相关基因的调 控，和耶O 诱导的造血干细胞增殖、分化方面的作用尚不明了。本文证实T P O 可诱 导人巨核细胞N F k B 族蛋白R e 忪( p 6 5 ) 的D N A 结合活性及体内
3、转录活性。进一步 分析表明酪氨酸激酶( P T K ) 和蛋白质激酶C ( P K C ) 抑制荆可以阻断T P O 的诱导作 用。综上所述，我们首次报道T P O 诱导的“酪氨酸激酶( 眦) 一蛋白质激酶C ( P K C ) N F k B R e n ( p 6 5 ) ”信号途径。 血小板生成素( 砸的) 是近年克隆的造血生长因子。T P O 通过与其受体M P L 的结合调节 细胞的增殖、分化。最初研究仅限于对血液巨核细胞的作用，更多的实验结果证明T P O 还作 用于早期造血于细胞，并能诱导其体内动员( m o b i l i z a t i o n ) 。新近的研究还表明红一巨核
4、白血 病细胞株的T P O 受体M P L 的表达异常增高，而且大多数急性粒细胞白血病的原代细胞中 T P O 受体M P L 的表达也异常升高。可以认为T P O 参与了正常和恶性血细胞增生的调控。 但是这种调控的机理尚不清楚，因此对T P O 诱导的细胞内信号途径的研究具有重要的理论和 实践意义。 N F k B 族蛋白是具有选择性D N A 结合活性的转录调控因子，在丝裂原诱导的细胞内信号 途径中，占有重要地位。同时，新近的研究表明N F k B 参与调控许多与细胞增殖及分化有关的 基因。基因剔除小鼠的结果证实N F k B 的重要成员R e A ( p 6 5 ) 基因具有强烈的抗凋亡
5、作用。 本项目受浙江省自然科学基金( 3 9 8 5 0 0 ) 和澳大利亚血液学会( A m 8 7 8 ) 资助 - - 1 3 5 但是对N F k B 在造血相关基因的调控方面的作用尚不明了。推测T P O 的活性可能涉及 N F I 圆族蛋白的作用。 ， 本文培育了一株T P O 依赖的人巨核细胞M 0 7 e T P O 作为实验模型，研究T P O 诱导 N F l d 3 族蛋白N F l d 3 的D N A 结合活性和体内转录活性。并分析了丝裂原激活的蛋白激酶 ( M A P K ) 的上游蛋白激酶( K 1 ) 、酪氨酸激酶( P T K ) 和蛋白质激酶C ( P K
6、C ) 抑制剂对上述 活性的影响。首次报道T P O 诱导的“酪氨酸激酶( 阿( ) 一蛋白质激酶C ( P K C ) N F k B R e A ( p 6 5 ) ”信号途径。 1 材料与方法 I L 一3 依赖的人巨核细胞M 0 7 e I L - 3 ( D r A s h m a nL K 赠，T h eH a n s o nC e n t r ef o rC a n c e r R e s e a r c h ，A d e l a i d e ，A u s t r a l i a ) 经长期诱导得到一株T P O 依赖的M o T e T P O 细胞，细胞增殖 动力学和形态学分
7、析证实其对r h u T P O 的绝对依赖性，以该细胞为模型研究T P O 的作用。 以含有N F k B 族蛋白特异结合的5 7 一G 1 3 ( 忑A a r I W C 一3 序列双链D N A 标记3 2 p 作探 针，与经r h u r h u T P O ( 购自R & DS y s t e mI n c C o ) 刺激的M 0 7 e r h u T P O 细胞核蛋白提取物 共同培养，借助胶阻滞试验( E M S A ) 观察T P O 诱导的D N A 结合活性。加入抗C r e l ，R e l A ( p 6 5 ) ，p 5 0 和p 5 2 的单克隆抗体( 购自S
8、 a n t aC r u zB i o t e c h n o l o g y ，C A ，U S A ) 鉴别与D N A 结合 的蛋白成分及活性状态的分子构型。 细胞体内的研究包括构建含2 x 5 一a 黝a 盯T C C 一3 ( 2 xl 【B ) 序列增强子的氯霉素醛 化酶( a 盯) 报告基因表达质粒( 购自C l o n e T e c h ，C A ，U S A ) ，并导人M 0 7 e r P o 细胞，以C A T E L I s A 技术观测r h u T P O 处理后C A T 基因的表达水平，推测T P O 诱导的N F l 出转录活性。 进一步以E M S A
9、 和W e s t e r n 杂交法观测酪氨酸激酶( P 1 瞰) ，丝裂原蛋白激酶的上游蛋白 激酶( 汜K 1 ) 、和蛋白质激酶C ( P I ( C ) 抑制剂除莠霉素( h e r b i m y e i n ) A ，P D 9 8 0 5 9 ，和H 一7 ( 均购 自N e wE n g l a n dB i o l a b s ，I n c ，M a r y l a n d ，U S A ) 探索P T K ，M E K l ，P K C 对N F k B 的D N A 结合 活性及转录活性的调控。 2 结果与讨论 2 1T P O 诱导N F i d i 蛋白D N A 结
10、合活性 经r h u T P 0 刺激6h 后E M S A 检测可见细胞和蛋白与双链D N A 探针结合形成两个泳速 不同的复合物：较慢的复合物C 1 和较快的复合物C 2 ；其中C 1 的强度随r h u l P O 浓度递增而 逐渐增加，浓度为2 5 0n g m l 达最高点。而C 2 的变化不明显( 图1 一A ) 。r h u T P O 处理另一 种T P O 非依赖性人巨核细胞M e g 0 1 则未见复合物的形成( 图1 一B 左) ；同样，I L 一3 和 M 0 7 e T P O 细胞共同培养也不能诱导C 1 ，但可诱导C 2 ( 图1 一B 右) 。表明C 1 是r
11、h u T 王叼作 用於M 0 7 e n ，O 细胞后所产生的特异性复合物。 在E M S A 反应中分别加入抗人C r e l ，R e 忪( p 6 5 ) ，p 5 0 和p 5 2 的单克隆抗体，可见抗人 R e A ( p 6 5 ) 抗体明显阻滞C 1 的移动；而抗人p 5 0 抗体则明显阻滞C 2 的移动。证实C 1 的主要 成贫由R e l A ( p 6 5 ) 蛋白和D N A 组成，C 2 的主要成分由p S o 蛋白和D N A ( 图1 一C ) 。在N F k B 蛋白家族中，R e A ( p 6 5 ) 是最重要的活性蛋白，常以R e l A ( p 6 5
12、) 一p 5 0 异源性二联体或R e n ( p 6 5 ) 一R e A ( p 6 5 ) 同源性二联体的形式结合於基因调控区相应的( 3 i s 元件，上调基因表达。 c l 中的绝大部分可被抗人R e A ( p 6 5 ) 抗体所阻滞，同时c 1 又不受抗人p s o ；c - r e l ，和p 5 2 的 1 3 6 单克隆抗体的影响，说明C 1 所含转录调控蛋白的优势形式是琢妞( p 6 5 ) 一R e 渔( p 6 5 ) 同源性 二联体。但是由于很少部分C 1 仍不被抗人R e 执( p 6 5 ) 抗体阻滞，提示未知转录调控蛋白形 式的可能性。 图l - I l D
13、诱导N F k B 蛋白D N A 结合活性 A 经n 刺激4h 后，E M S A 检测可见细胞和蛋白与双链D N A 探针结合形成两个泳速不同的复合物：较慢的复 合物c 1 和较快的复合物Q ；其中C 1 的强度随T P O 浓度递增而逐渐增加，浓度为2 5 0 眶h d 达最高点。而C 2 的变化 不明显。( 3 次重复实验结果相同) B T P O 处理另一种非依赖性人巨核细胞M 唔一0 1 则未见复合物的形成；同样，I L 一3 和M 0 7 e n o 细胞共 同培养也不能诱导D N A 结合活性。( 3 次重复实验结果相同) C 在E M S A 反应中分别加入抗人C r e l
14、 ，R e 魄( p 6 5 ) ，p 5 0 和p 5 2 的单克隆抗体。可见抗人R e A ( p 6 5 ) 抗体明显阻 滞c 1 的移动( 泳道5 ) ；而抗人p 抗体则明显阻滞C 2 的移动( 泳道3 ) 。( 3 次重复实验结果相同) - 1 3 7 - 2 2r h u T P O 诱导M 0 7 e 珊l o 细胞内N F i d i 蛋白转录活性 构建p T KC A T ( 2 xk B ) 报告基因表达质粒，其增强子含双重N F k B 序列，用磷酸钙法导 人M 0 7 e 侧细胞，以不含N F k B 序列的p T KC A T 表达质粒为对照。经浓度为2 5 0n g
15、 m l 的r h u T P O 刺激，测定C A T 的活性以指示体内N F l d 3 蛋白转录活性。结果显示p T KC A T ( 2 x k B ) 组C A T 活性升高见於刺激0 5 6 0h ，高峰位于4h ，1 2h 回到起始点。p T KC A T 对照 则未改变( 图2 ) 。 O 3 46 1 2 T i m ef o rT P Ot r e a t m e n t ( h o u r ) 圈2 I m 诱导M 0 7 e 俩细胞内N F k B 蛋白转录活性 用磷酸钙法将p T KC A T ( 2 xl 出) 报告基因表达质粒导入M 0 7 e T P O 细胞。
16、以不含N F k B 序列的p T KC A T 表达质粒为对照。经浓度为2 5 0n g m l 的n 】0 刺激，测定0 至1 2h C A T 的活性，指示N F k B 体内蛋白转 录活性。( 实线代表p T Ko 垤( 2 xk B ) 报告基因，虚线代表p T KC A T 报告基因。本图为5 次实验结果) 细胞体内实验的结果进一步证实E M S A 体内外分析的结果，说明r h u T P O 所诱导的 珊蛋白的D I 蛆结合具有转录调控活性，综合上述资料可以断定这种转录调控活性主要来 自R e l A ( p 6 5 ) 蛋白。 以往的工作已经证明N F l 【B 族蛋白的调控活性主要见诸于细胞对刺激物的早期反应。本 文r h u T P O 所诱导的R e l A ( p 6 5 ) 蛋白转录调控活性以C A T 的活性为标志，始於刺激O 5h ，4h 即达最高，1 2h 回到起始点，反映r h u T P o 对
