《生物分离与纯化技术(生化工艺)第2章 预处理及固液分离综述》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物分离与纯化技术(生化工艺)第2章 预处理及固液分离综述（61页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第2章 预处理及固液分离 重点：预处理的作用及常用方法 凝聚与絮凝的原理及异同点 杂蛋白、高价无机离子的去除方法 常见的细胞破碎方法、适用范围、影响因素 改善过滤的方法 一.生化分离工程的工艺流程： 第1节 发酵液预处理 二.常见的预处理方法 悬浮液的基本特性 细胞的相对密度与培养液相似 可压缩性，粘稠，非牛顿流体，流 变行为复杂 悬浮状态稳定 改善发酵液的物理性质 ：流变性质、颗粒粒度 预处理 的目的 去除部分杂质：杂蛋白、 多糖、高价无机离子等 二.常见的预处理方法 物理性 质的改善 杂质 的去除 预处理 的方法 加热（降低黏度、 去除杂蛋白） 凝聚与絮凝（增大 粒度） 加助滤剂（改善过
2、滤） 去杂蛋白（等电点、变 性剂、吸附） 去多糖（酶解） 去离子（沉淀） 二.常见的预处理方法 凝聚是在高价无机盐作用下，由于经典排斥力的 降低，而使胶体体系不稳定的现象。 絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥 作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物 理的集合为主的过程。 凝聚和絮凝技术 胶体粒子的电荷一旦被中和，其排斥力消失，胶 体粒子就会在分子间吸引力作用下聚集沉淀。 胶粒能保持分散状态的原因主要是带有相同电荷 ，一旦由于布朗运动使粒子间距离缩小即产生排斥力 使两个粒子分开，从而阻止了粒子的聚集。 常用的凝聚剂 Al2(SO4)3.18H2O，AlCl3.6H2O，FeCl3
3、， ZnSO4，MgCl2 阳离子对负电荷的胶粒凝聚能力次序为： Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+ n絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对 分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构 ，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的 阴离子（如-COOH）或阳离子（如-NH2） 基团以及不带电荷的非离子型基团。 n它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用， 强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物 的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生 桥架连接时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝 作用。 絮凝 絮凝原理 l 絮凝剂用量:絮凝效果呈钟形变化。 l 溶液的pH：pH主要影
4、响离子型絮凝剂中功能团 的电离度，从而影响了分子链的伸展状态，改变了 架桥能力。 l 搅拌速度和时间： l 助滤剂：添加助滤剂能增加絮凝效果。 絮凝作用的影响因素： 1.聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）衍生物： 非离子型、阴离子型（含-COOH）、阳离子型（含-NH2） 由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般以ppm计量，絮凝体粗大 ，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适用范围广。 2.天然有机高分子絮凝剂 明胶、海藻酸钠在食品工业上应用较多 壳聚糖在生物产品分离中用得最多 常用絮凝剂的种类： 二、 杂蛋白的去除 等电点沉淀 蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。胶体粒 子的
5、稳定性和其所带电荷有关。 蛋白质在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小， 称为等电点。因为羧基的电离度比氨基大，故 蛋白质的酸性性质通常强于碱性，因而很多蛋 白质的等电点都在酸性范围内（pH 4.05.5 ）。 二、杂蛋白的去除 变性沉淀 蛋白质从有规则排列变为不规则结构的过 程称为变性。 加热：在链霉素生产中，在pH3.0时，加 热至7075，维持30min，黏度降为 1/6，过滤速度提高3倍。 加有机溶剂、表面活性剂、酸碱等。 二、杂蛋白的去除 在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸 盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过 氯酸盐等形成沉淀； 在碱性溶液中，能与一些阳离子，如Ag，
6、Cu2， Zn2，Fe2和Pb2等形成沉淀。 变性蛋白质溶解度较小。最常用的使蛋白质变性的 方法是加热。加热还能使液体粘度降低，加快过 滤速度。该法只适用于对热较稳定的生化物质。 二、杂蛋白的去除 吸附 在发酵液中加入一些反应剂，相互反应后生成的 沉淀物可吸附蛋白质而使其沉淀。如在四环素 发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，两者反应生成 K2Zn3Fe(CN)62 在枯草杆菌的碱性蛋白酶发酵液中加入氯化钙和 磷酸盐等 三、 不溶性多糖的去除 当发酵液中含有较多不溶性多糖时，黏度 增大，固液分离困难，可用酶将其转化 为单糖。 三、 高价无机离子的去除 n除去Ca2草酸钠 nMg2 草酸根（草酸镁溶解度稍
7、大） 或磷酸盐 nFe2 黄血盐（生成普鲁士兰沉淀） 第2节 细胞破碎 细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自 于肽聚糖的网状结构。 细胞壁的组成 酵母菌：葡聚糖， 甘露聚糖，蛋白质 ，主要阻力来自于 壁结构交联的紧密 程度和厚度。 丝状真菌：多糖，蛋 白质，脂类，葡聚糖 ，几丁质，主要阻力 来自于壁强度和聚合 物网状结构。 微生物细胞的破碎技术 高压匀浆法 高压匀浆器 采用高压匀浆器是 大规模破碎细胞的 常用方法，利用高 压迫使细胞悬浮液 通过针形阀，由于 突然减压和高速冲 击撞击环造成细胞 破裂 高压匀浆器 高压匀浆法特点 n破碎率较高 n适合大规模细胞破碎 n碎片细小，胞内物质释放完全
8、 n适合格兰氏阴性菌和酵母的破碎，不适合 霉菌和格兰氏阳性菌 影响因素 n操作压力（5070MPa） n细胞浓度（20） n温度 n循环次数(25) 珠磨法 珠磨法是常用的一种方法，它将细胞悬浮 液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎 。 珠磨法特点 n破碎率较高 n适合大规模细胞破碎 n碎片较小，胞内物质释放完全 n温度容易急剧上升，需要良好的降温配套设备 n相对与酵母和细菌，珠磨法更适合真菌菌丝和 藻类 影响细胞破碎的因素 n搅拌速度（7001450r/min） n料液的循环速度（50500L/h） n细胞浓度（0.30.5g/mL） n珠粒大小和填充量
9、 （0.451mm；7090) 细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产 生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘 滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应 力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破 碎。 对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不 同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比 革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果 极差。 该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入 很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。 超声波法 电声超声波发生器 采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞 内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有 机溶剂等化学试剂 酸碱调节pH，改变蛋白质的电荷，使其与其他物质作 用力下降
10、 有机溶剂能大量渗透进入细胞，造成细胞膨胀破碎 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 ，常 用于无色杆菌、芽孢杆菌、梭菌、假单胞杆菌破碎 表面活性剂能使脂溶性成分溶解而是胞内物质渗漏出 来 化学法 优点：细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释 放少，便于后步分离、不需要专门设备，对产物的释出 选择性好等优点，故使用较多。 缺点：易导致活性物质破坏、化学试剂的加入，常会给随 后产物的纯化带来困难 化学法 利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的 键，从而达到破壁的目的。 优点：专一性强，发生酶解的条件温和 。 缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于 小规模的实验室研究。 溶菌酶是应用最多的酶，它
11、能专一地分 解细胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷键 ，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细 胞移至低渗溶液中使细胞破裂。 酶解法 渗透压冲击 是较温和的一种破碎方法，将细胞放在 高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或 蔗糖溶液)，入达到平衡后，介质被突然 稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中， 由于渗透压的突然变化，水迅速进入细 胞内，引起细胞壁的破裂。 渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的 菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成 受抑制而强度减弱时才是合适的。 冻结-融化法 将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融 化，反复多次而达到破壁作用。 对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法 。但通常破碎率很低即使反复循环多次
12、 也不能提高收率。另外，还可能引起对 冻融敏感的某些蛋白质的变性。 机械破碎法与非机械法比较 破碎方法的选择 破碎目标待破碎细胞的机械强度 破碎条件目标产物对破碎条件的 敏感性 细胞的量 破碎率的测定 1.直接测定法：细胞计数 2.测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导 率 第3节 发酵液的固液分离 固液分离的目的： 收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，或 者是收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮 物，如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物 和它们的絮凝体等。 过滤 影响过滤的因素： n发酵液的性质：黏度、粒度、颗粒含量、滤饼 的性质 n过滤装置：过滤面积、料液分布效果 n过滤操作条件：
13、压力、过滤方式 过滤 改善过滤过滤 的方法 (一）预处预处 理：改善发发酵液性质质 （二）助滤剂滤剂 ：能改善过滤过滤 操作的质质地坚坚硬不可压压 缩缩性固体 机理：表面吸附胶体及不可压缩压缩 型格子结结构 助滤剂选择滤剂选择 ：粒度与悬悬浮颗颗粒适当 使用方法： a 预预先制成滤饼滤饼 ：滤滤液澄清度高 b 助滤剂滤剂 混入悬悬浮液中一起过滤过滤 ：容易达到滤滤速最 大 c 两种方法混用 常用助滤剂滤剂 ：硅藻土，珍珠岩，活性炭 （三）优优化过滤过滤 装置 板框压缩机 鼓式真空过滤机 过滤的常用设备： 转鼓真空过滤机 DryWash Immersion Knife Cake Feed Rot
14、ary vacuum filter 转鼓真空过滤机 离心分离 借助离心机旋转所产生的离心力，使不同 大小和不同密度的物质分离的技术 细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常 用离心分离 超速离心技术已成为分离、纯化、鉴别和 各种生物大分子的重要手段之一 (1)利用物质的不同密度进行分离 (2)离心方式多： 离心沉降、离心过滤、差速离心、速率区带离心、 密度离心等 (3)应用广: a活体生物离心(细胞、微生物、病毒) b细胞器离心(细胞核、细胞膜、线粒体) c生物大分子离心(核酸、蛋白质、酶、多聚物) d小分子聚合物合物等。 特点： 差速离心 差速沉淀离心(differential centrifu
15、gation)系 指分步改变离心速度，用不同强度的离心 力使具有不同质量的物质分批沉淀分离的 方法，它适用于沉降系数差别在一到几个 数量级的混合样品的分离，对于差别较小 的物质，差速离心难以得到满意的分离效 果。 等密度离心 保证絮凝效 果最佳 碱化 分离实例 n乳酸发酵液预处理 80保温 3min 发酵液 变性去除 杂蛋白加适量 CaCO3 调节 pH4.0 壳聚糖50mg/m3 于30搅拌5min 加硅藻土作助滤 剂，板框过滤 滤液 活性炭 脱色 过滤， 取虑液 浓缩 （蒸发、 膜分离） 结晶 （降温至 510 ） 洗涤 、 酸解 、 脱色 、 过滤 成品 保证产物稳 定 稀释 分离实例 n透明质酸发酵液预处理 1/2V10% TCA 发酵液 变性去除降解 酶及杂蛋白 0.8V95% 乙醇 调节 pH7.0 加硅藻土作助滤 剂，板框过滤 滤液 2V 95%乙醇 离心粗品
