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1、 第三章 吸 附 层 析 层析又称为色谱或色层，是俄国植物学家茨 维特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分 离纯化方法。其总的原理是根据各种被分离组分 在固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目 的 层析法根据其层析类型，可分为柱层析、纸 层析和薄层层析；根据具体分离原理分，可分为 吸附层析、分配层析、疏水层析、离子交换层析 、亲和层析、凝胶过滤层析等具体层析方法 吸附层析（absorption chromatography）又称色层法 或色谱法；是根据各种被分离组分在固定相和流动相的 分配系数不同达到分离的目的一类分离纯化方法 吸附层析的概念 目 的 掌握 吸附柱层析、薄层层析及聚酰胺薄层
2、层析的基本原理和操作方法 层 析 方 法 的 类 型 第一节 吸 附 柱 层 析 吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相制备成色谱 柱，以有机溶剂或缓冲液为流动相，用于分离纯化的 一种层析方法 吸附柱层析的概念 吸附层析 的固定相 极性:如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等 非极性：如活性碳等 流动相通常为有机溶剂或缓冲液 一、常 用 术 语 1固定相 固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质(如吸 附剂、离子交换剂)和液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的 溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶 解和交换作用 2流动相 在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体 或气体。在
3、柱层析中又称为洗脱剂或洗涤剂；在薄层层析中 又称为展开剂 3层析 以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动 相，使有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分 配、吸附或交换，最终使混合物得到分离的过程 4操作容量 是反映基质（固定相）对某种成分的结合能力的指标 ；它表示在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡 时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克(或毫升)基 质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。其数值大 ，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之 5床体积(Vt) 是指膨胀后的基质在层析柱中所 占有的体积(Vt)。它是基质的外水体积 (Vo)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)
4、的 总和，详见图3-1，即V=Vo+Vi+Vg 6洗脱体积(Ve) 是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达 到最大值时的流动相体积。用Ve 表示(见图3-7中OB) 7外水体积(Vo) 外水体积指基质颗粒之间体积的总和 8内水体积(Vi) 内水体积是指基质颗粒内部体积的总和 9基质体积(Vg) 基质体积是指基质自身所具有的体积。 Vo、Vi和Vg都是随着床体积和基质性质变化而变 化的 10膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积 （用V表示）。即每克溶胀基质所具有的床体积 一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大 11分配系数 是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K
5、表示 12.迁移率 指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移 动距离之比值。常用Rf表示 二、基本原理 利用被分离样品中不同组分与吸附剂之间吸附能力的差异 （或各组分的分配系数不同）进行分离。吸附能力大（或分 配系数大）的组分在柱子上的保留时间长，吸附能力小（或 分配系数小）的组分很快被洗脱 混合物在层析柱中分离的过程实质上是吸附与解吸附的 过程 三、吸 附 剂 （一）吸附剂的选择 1.具备条件：表面积大、吸附选择性好、稳定性强、成本 低廉等 2.选择原则：由吸附剂本身和被吸附物质的理化性质而定 。根据“相似相溶”原理，为了便于解吸附（洗脱），对于 极性强的分离物，应选择极性小的吸附
6、剂；而对于极性弱 的分离物则选择极性强的吸附剂 （二）吸附剂的性质 20世纪50年代初期，Tiselius等用制备的羟基磷灰 石Ca5(P04)3OH2（HA）分离蛋白质。目前国内已 有商品出售 1.羟基磷灰石 （1）性质 吸附容量高 稳定性好（T85，pH5.510.0均可使用） 使用广泛（可用于制备和纯化pro、酶、核酸等） 分离效果好 HA的Ca基团与生物分子表面的负电荷基团的作用 ，对分离起重要作用；而PO4基团与生物分子表面的 正电荷的作用仅起次要作用 u使用HA作为固定相基质时应注意 HA为干粉时，需事先浸泡膨胀达到23ml/g后，按16加入 缓冲液悬浮，除去细小的颗粒 HA悬浮液
7、需用旋涡振荡器混合，因为其他搅拌器如磁棒、 玻棒等易破坏其晶体结构 忌用柠檬酸缓冲液和pH5.5的缓冲液处理 色谱柱再生时，先用1 mol/L NaCl洗涤，然后用4倍床体积 的平衡缓冲液冲洗即可 细颗粒HA的操作容量和分辨率均较大颗粒高，但须采用较 大直径的柱子 2.硅胶 （1）性质 含水量：含水量高，则吸附性（活性）小，当其 表面游离水含量17%时，其结合力很小；此时 仅能作为分配层析的固定相 粒度：粒度小，则分离效果较好（如用200400 目的硅胶能有效地分离多种生物的有效成分） （2）活化：110烘烤0.51h。活化后立即使用或短期贮存 与干燥器中 四、洗脱剂 条件 纯度较高 稳定性好
8、 能较完全地洗脱下被分离的成分 黏度小 易和所需的成分分开 选择洗脱剂的顺序应从极性小 大 一般，pro或核酸被极性强的HA吸附后，要用含有 盐梯度的缓冲液洗脱；而甾体、色素等化合物被极性较 弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱 五、层析柱的制备和层析操作 （一）层析柱 层析柱是下端为细口并带有筛板的玻管。柱子的直径与 长度之比一般为110140；吸附剂颗粒极细时，宜选用大比 例（粗）的层析柱，反之用细层析柱，这样可节省时间和提 高分辨率。层析柱的床体积由吸附剂的量和膨胀度决定 （二）吸附剂的用量 吸附剂的用量主要由吸附剂自身的操作容量和分离物中 各成分的性质决定（一般为被分离样品的3050倍）
9、 当操作容量小时，则吸附剂用量要大；另外，当样品中各 组分的性质相似，难以分开时，应加大吸附剂的用量，有时 甚至超过100倍 （三）装柱 1.干法装柱直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂 此法不易排尽气泡，容易导致层析不均匀 2.湿法装柱 先加适量溶剂至柱内，排走空气，然后将预先浸 泡好的吸附剂搅均，随即将此混悬液倾入柱中（ 图3-5）；待其自然沉淀至柱高的1/4 1/3 时，打 开下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱子上端悬浮 液徐徐下降至需要的高度；并用23倍量的洗脱剂 流过层析柱，使其达到平衡 注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严防 产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡 （四）上样和
10、洗脱 经平衡好的层析柱，当平衡液到达固定相表面时，用滴管轻轻地 将待分离样品液加置固定相表面（注意避免冲动基质，且样品液体 积应小于床体积的1/2）；待样品液进入固定相时，用滴管加洗脱剂 ，并在上端连接洗脱剂瓶连续洗脱，同时下端与部分收集器接通， 分级收集 将收集的每管溶液进行浓缩和活性测定。以管号或洗脱体积为横 坐标，每管样品的浓度或活度为纵坐标，若层析峰无重叠，则各成 分能完全分离（图3-7） 为了获得满意分离效果，洗脱速度恰当控制（若太快，洗脱物在 两相中平衡不完全；太慢，则洗脱物会扩散；结果都会导致分离度 下降） 分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定及保存 加 样 操 作 示
11、 意 图 （五）柱子再生 各种层析柱，其再生方法因固定相不同而异 (1)纯化生命物质72： 天然的双链(ds)和热变性单链(ss)小牛胸腺DNA在HA层析柱 的分离图谱 六、实例应用 (2)分离蛋白质的亚基114 14C-组氨酸标记的兔球蛋白亚基在HA层析柱的分离图谱 第二节 薄 层 层 析 薄层层析(thin layer chromatography，TLC)是以 涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体 为流动相的一种层析方法 薄层层析的概念 1展层时间短，薄层层析分离混合物一般仅需1560min 2设备简单、操作方便，既适用于分析，也适用于制备 3温度变化和溶剂饱和程度对Rf值影响较小 4可使用腐蚀性显色剂(用淀粉作黏合剂和葡聚糖凝胶作固 定相的薄板除外) 5灵敏度高 薄层层析有以下优点 第三节 聚酰胺薄膜层析 聚酰胺薄膜层析是1966年之后发展起来的一种层析方 法。特别应指出的是，用此法分析氨基酸衍生物DNP-氨 基酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸以及DABTH-氨基酸1） 时，具有灵敏度高、分辨力强、展层迅速和操作简便等优 点，它超过了这类化合物过去使用的纸层析、纸电泳和薄 层层析(茚三酮法)等方法 一、聚酰胺薄膜层析的概念 1用DNS氨基酸的聚酰胺薄膜层析鉴定肽N末端 二、应用实例 2用DABTH氨基酸的薄层法分析蛋白质序列
