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1、南方医科大学 博士学位论文 蛋白酶体抑制剂MG-132对高氧肺损伤的影响及其机制研究 姓名：黄宇戈 申请学位级别：博士 专业：儿科学（危重症基础与临床） 指导教师：封志纯 20080606 博士学位论文 蛋白酶体抑制剂M G 13 2 对高氧肺损伤 的影响及其机制研究 博士研究生：黄宇戈 指导老师：封志纯教授 摘要 研究背景： 氧是我们机体重要的组成元素，氧气在能量代谢中起关键的作用。在生理 条件下，肺泡上皮细胞有氧代谢过程中活性氧簇( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ， R O S ) 处于一种低水平激活状态，为了降低氧损伤，机体有完善的抗氧化
2、系统清 除氧化产物。然而，过度激活R O S 会破坏抗氧化系统而损伤细胞内组成，最终 引起细胞死亡，组织炎症反应和损伤。湿润的支气管和肺泡上皮细胞直接接触 高氧环境是最容易受氧化激活损伤。蛋白的氧化损伤和肺生理功能的丧失是高 氧肺损伤的结局之一。目前的研究多数集中于探讨抗氧化酶如何减轻高氧引起 的气道损伤，譬如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶等。在 高氧暴露早期为了维持肺泡上皮细胞内环境的稳态，清除氧化损伤蛋白的生物 途径可能充当了重要的作用。 泛素一蛋白酶体途径( U b i q u i t i n P r o t e a s o m eP a t h w a y ，U P P
3、 ) 是一种高效 的蛋白分解途径，是一种清除损伤或陈旧蛋白质的重要途径，广泛存在于细胞 胞浆、细胞核和内质网中。该通路参与N F - KB 通路的激活，研究发现N F KB 通路在高氧肺损伤病理变化中起着重要的作用。然而，泛素一蛋白酶体通路是否 直接参与高氧肺损伤的病理过程，尚不清楚。在高氧肺损伤的发病过程中氧化 应激与泛素蛋白酶体通路功能之间的关系尚未阐明：蛋白酶体抑制剂是否能通 过抑制泛素一蛋白酶体通路，影响多种炎症介质介导的高氧肺损伤的病理生理学 中文摘要 过程? 目前，M G - 1 3 2 作为蛋白酶体的抑制剂，用于高氧肺损伤的研究，尚未见 报导。因此，我们提出假说：如果泛素蛋白酶体
4、通路参与高氧肺损伤的病理过程， 那么抑制其活性，有可能会减少炎症因子的激活，减轻高氧导致的肺损伤。 研究目的： ( 1 ) 观察高氧暴露早期对肺脏的影响。 ( 2 ) 通过观察泛素一蛋白酶体通路是否激活，进一步观察蛋白酶体抑制剂 M G - 1 3 2 对高氧暴露肺组织形态学和氧化激活指标的影响，探讨蛋白酶体抑制剂 M G - 1 3 2 是否对高氧肺损伤有影响。 ( 3 ) 同时观察肺组织嗜中性白细胞侵润情况，以及N F KB 炎症因子通路 的变化，进一步探讨蛋白酶体抑制剂M G 一1 3 2 可能的作用机制。 研究方法与内容： ( 1 ) 建立高氧肺损伤大鼠模型。 ( 2 ) 实验采用完全
5、随机设计。S D 大鼠3 0 只，分为3 组，每组1 0 只大鼠。 ( 1 ) 空气对照组：持续吸入空气( F i 0 2 = 0 2 1 ) 7 2 小时，于实验第1 天开始腹腔 内注射D M S OO 2 5m l ，注射3 天；( 2 ) 高氧组：持续吸入高浓度氧( F i 0 2 0 9 5 ) 7 2 小时，于实验第1 天开始腹腔内注射D M S O0 2 5m l ，注射3 天；( 3 ) 高氧 + M G 1 3 2 组：于实验第1 天开始腹腔内注射M G - 1 3 2 ( 1 0 m g k g d ，溶解于D M S O O 2 5m l ，注射3 天) ，其余处理同高氧组
6、。于实验开始后0 、2 4 、4 8 、7 2 小时 观察大鼠心率、呼吸变化，其余指标均于7 2 小时时检测。 ( 3 ) 为了评价模型我们用心电监护观察大鼠心率、呼吸变化：进行形态 学观察：大体病理分级，进行肺损伤病理评分；测定肺水肿指标肺湿干重比例。 ( 4 ) 测定肺匀浆丙二醛0 V D A ) 水平、超氧化物歧化酶( S O D ) 活性间接反映 肺组织氧化损伤和氧化应激情况。 ( 5 ) 免疫组织化学方法和W e s t e r nb l o t 方法检测肺组织泛素化蛋白 ( U b i q u i t i n U b i q u i t i n - C o n j u g a t
7、e s ) 的表达，检测蛋白酶体2 0 S 的活性，评价泛 素蛋白酶体途径激活情况。 ( 6 ) 检测肺组织匀浆髓过氧化物酶( M P O ) 活性，免疫组织化学方法检 U 博士学位论文 测肺组织N F r , Bp 6 5 表达，R T - P C R 检测肺组织细胞因子T N F a 、I L 6 的表达， 反映肺组织N F - gB 炎症因子通路的活化情况。 结果： ( 1 ) 成功复制高氧肺损伤大鼠模型： ( 2 ) 大鼠高氧暴露后，呼吸、心率逐渐增快( P 硝酸纤维素膜( N C 膜) 滤纸的顺序，剪好一张N C 膜和8 张新华滤 纸，将N C 膜在蒸馏水中浸泡5 m i n , 以
8、消除气泡，同时用电转移缓冲液浸泡滤纸、 1 9 第一章蛋白酶体抑制荆M 6 - 1 3 2 对高氧肺损伤的影响 凝胶海绵1 0r a i n 。将电转移装置中的黑色多孔塑料夹放在最低层，再依次放置海 绵、4 层滤纸、凝胶、N C 膜、4 层滤纸、海绵、无色多孔塑料夹，赶走气泡合扰 夹子，放入电转移槽中，黑的靠黑的，白的靠红的，按凝胶侧阴极，N C 膜侧阳 极连接好电极，加上电转移缓冲液于+ 4 冰柜中进行电转移，恒流9 0m A 电转 移约1 4 h 。 1 1 2 5 4 封闭及抗原抗体反应 从电泳槽上取出转移好的N C 膜，切一角做标记放入一平皿中，用T B S 洗一 次，以除去N C 膜
9、上的凝胶。采用丽春红S 染色液染色5 m i n , 观察电转移效果。T B S 洗涤3 次，倾去T B S 后用1 x B l o t t o 封闭液在平缓摇动的摇床上，室温封闭2 h 。封闭 结束后，将膜转移至一可加热封1 3 的塑料袋中，按0 1 m l e m 2 的量加入封闭液及 适量的第一抗体( u b i q u i t i n1 - 1 0 0 0 ，1 3 - a e t i n1 ：3 0 0 ) ，封1 2 1 后在平缓摇动的摇床 上室温反应4h 。剪开塑料袋，将N C 膜放入平皿中，用大量T B S 洗3 次，每次l O m i n 。洗涤后将N C 膜放入另一新的可加
10、热的塑料袋中，按0 1 m l c m 2 的量加入封闭 液及适量的第二抗体( 连有辣根过氧化物酶的兔抗小g I g G ，1 ：1 0 0 0 ) ，封口后室 温摇床2h 。取出N C 膜，T B S ( 不含T w e e n 2 0 ) 洗3 次，每次1 5m i n ，以除去未结合的 二抗。 1 1 2 5 5显影及图像分析 于暗室中将E C L 试剂的A 、B 液在一个小平皿中等量混合，按0 1 2 5m l e m 2 的量加于N C 膜上，室温反应5 m i n 。取出N C 膜，滤干，剪取适当大小的X 光片覆 盖于膜上，二者间用透明塑料片隔开，夹于暗盒中曝光适当时间后，取出X
11、光片 放入显影液中，待出现清晰的影像时用自来水冲洗几次，再放入定影液中定影 2 0 m i n 。取出X 光片自来水冲洗，凉干再翻拍成照片永久保存。图像经扫描仪扫 描后用A l p h a e a s eF C4 0 0 图像分析软件进行光密度积分值分析。 1 1 2 6 蛋白酶体2 0 S 活性的测定 1 1 2 6 1 实验方法 电子天平上称取等量肺组织，取A 液4m l 若干加入E P 管匀浆后，2 5 0 0 g g 博士学位论文 , 心1 5 m i n ，4 保存，取1 0I Il 上清，加入装有反应工作液B 液2m l 的E P 管中，再 加入2 5um m o l LS L L
12、 V Y - A M C ，然后加入0 0 2 S D S ，在恒温水浴箱中3 7 “ C 温育 3 0m i n ，取出后再分别加入乙醇3 0 0ul ，终止反应。紫外可见分光光度仪检测 蛋白酶体2 0 S 的活性，将激发光和发射光波波长调至3 5 0 4 4 0t i m 之间，底物 S L L V Y - A M C 被降解后，释放出发光物质A M C ，检测该物质的量，即为蛋白酶体的 活性。 1 1 3 统计方法 计量资料均以均数标准差( x s ) 表示，采用S P S S1 3 0 软件进行实验 数据统计分析，各组新生大鼠心率、呼吸参数采用重复测量数据方差分析；W D 、 肺组织匀
13、浆M D A 、S O D 、免疫组化检测结果采用单因素方差分析，组间多重比较 比较采用L S D 法；病理分级结果采用等级资料的秩和检验。P o 9 57 2 小时；( 3 ) 空气+ M G - 1 3 2 组：于实验第l 天开始腹腔内 注射M G - 1 3 2 ( 1 0 m g k g d ，溶解于D M S O O 2 5m l ，注射3 天) ，其余处理同空 气组；( 4 ) 高氧+ M G 一1 3 2 组：于实验第1 天开始腹腔内注射M G - 1 3 2 ( 1 0 m g k g d ， 溶解于D M S O0 2 5m l ，注射3 天) ，其余处理同高氧组。技术路线见
14、图2 。 于实验7 2 小时各组取5 只大鼠麻醉，无菌打开胸腔，分离肺组织，其中右 肺组织用于免疫组化检测，肺组织用4 多聚甲醛固定；另外5 只大鼠麻醉，无 菌打开胸腔，分离肺组织，迅速将左肺组织标本用液氮保存以备用，进一步作总 R N A 抽提及半定量R T - P C R ：右肺组织匀浆用于M P O 的检测。 博士学位论文 图2 1 ：实验技术路线 F i g u r e2 - 1 ：T e c h n o l o g yr o a d m a p 2 1 4 3 免疫组织化学法检测肺组织N F KBp 6 5 的表达 2 1 4 3 1 免疫组织化学法染色方法 ( 1 ) 切片以二甲苯
15、脱蜡( 二甲苯I2 0 m i n ，二甲苯1 1 2 0 r a i n ) 。 ( 2 ) 入逐级酒精( 1 0 0 ，9 5 ，8 0 ，7 0 ) 至蒸馏水。 ( 3 ) 蒸馏水冲洗3 r a i n 。 ( 4 ) P B S 浸泡5 m i n 。 ( 5 ) 3 H 2 0 2 孵育1 0r a i n ，以消除内源性过氧化物酶活性。 ( 6 ) 蒸馏水冲洗2 r a i n ，P B S 冲洗3 m i n x 2 次。 ( 7 ) 滴加封闭用正常山羊血清工作液室温孵育1 5 r a i n 。 第二章蛋白酶体抑制荆M G - 1 3 2 对高氧损伤肺组织的炎症抑制作用 ( 8
16、 ) 倾去血清，滴加一抗兔抗鼠N F KBp 6 5 单克隆抗体，用抗体稀释液 以l ：3 0 0 的浓度稀释) ，置4 “ C 冰箱过夜；每组切片另设两张阴性对照，以P B S 代替一抗。 ( 9 ) P B S 冲洗，3 m i n x 3 次。 ( 1 0 ) 滴加生物素化二抗工作液( 生物素标记山羊抗兔I g G ) ，室温孵育 2 0 m i n 。 ( 1 1 ) P B S 冲洗，3 m i n x 3 次。 ( 1 2 ) 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育2 0 m i n 。 ( 1 3 ) P B S 冲洗，3 m i n x 3 次。 ( 1 4 ) 显色剂D A B 显色，光镜下观察染色5 1 0 m i n 。 ( 1 5 ) 自来水终止反应，蒸馏水充分冲洗。 ( 1 6 ) 复染：苏木素染色3 m i r a 自来水冲洗；2 盐酸酒精分化l s e c ；自来 水。 ( 1 7 ) 入梯度
