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1、华中科技大学 博士学位论文 葡萄籽提取物原花青素对人膀胱癌细胞生长的抑制作用及机制 研究 姓名：刘洁 申请学位级别：博士 专业：外科学泌尿外科学 指导教师：庄乾元 20090501 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3 中 文 摘 要 第一部分 葡萄籽提取物原花青素对人膀胱癌 BIU87 细胞的生 长抑制作用 目的目的 探讨葡萄籽提取物原花青素(grape seed procyanidin extract，GSPE)对人膀胱癌 BIU87 细胞及人原代皮肤成纤维细胞生长的影响。 方法方法 体外培养的人膀胱癌 BIU87 细胞及人原代皮
2、肤成纤维细胞与 12.5、 25、 50、 100 和 200 g/ml GSPE 共同孵育 24 h 后，观察细胞形态学改变；并采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法测定其对人膀胱癌 BIU87 细胞及人原代皮肤成纤维细胞存活的影响。 结果结果 与对照组相比，50、100、200 g/ml GSPE 可引起 BIU87 细胞形态的明显改变， 各浓度 GSPE 对人原代皮肤成纤维细胞形态无明显影响。 12.5、 25、 50、 100、 200 g/ml GSPE 作用细胞 24 h 后，人膀胱癌 BIU87 细胞存活率分别为对照组的 99.550.50% (n=18, P0.05), 99.1
3、60.63% (n=18, P0.05), 86.981.48%(n=18, P0.05), 99.160.63% (n=18, P0.05), 86.981.48%(n=18, P0.05)、 86.981.48%(n=18，P0.05)、 98.920.67%(n=18， P0.05)、 99.040.74%(n=18， P0.05) 和 98.810.66%(n=18，P0.05)；与对照组相比，50、100 和 200 g/ml GSPE 可明显 抑制 BIU87 细胞生长，但对人原代皮肤成纤维细胞生长无明显抑制，见图 3。 *表示与对照组比较差别有统计学意义(P0.01)。 图 3
4、GSPE 对人膀胱癌 BIU87 细胞和人原代皮肤成纤维细胞存活的影响 3 讨论 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 22 葡萄籽提取物原花青素是从葡萄籽中提取出来的多酚化合物，具有广泛的生物 学、药理学及治疗学作用。研究表明，GSPE 具有极强的抗氧化、清除氧自由基活性 1,2，据报道其在体内抗氧化能力是维生素 E 的 50 倍，维生素 C 的 20 倍3。是一种天 然的抗氧化剂。近年来，GSPE 在肿瘤防治中的作用越来越受到人们的重视，但在膀 胱癌中尚未见报道。 研究表明， GSPE 对多种人类肿瘤均有一定的抑制生长作用。 Ye 等
5、4发现 25 mg/L 的 GSPE 与人乳腺癌细胞 MCF-7 共同培养 24、48 和 72 小时后，可分别引起 MCF-7 细胞 6.5%、 30%和 43%的生长抑制； 50 mg/L 的 GSPE 培养相同时间时， 对应的 MCF-7 细胞生长抑制率分别为 11%、35%和 47%。其在人肺癌 A-427 细胞和人胃腺癌细胞中 的研究也得到了类似的结果。对于正常胃黏膜细胞，GSPE 却可以促进其生长并增强 细胞的活力。Chatelain 等5在口腔鳞癌中的研究发现，GSPE 可呈剂量依赖性抑制口 腔鳞癌细胞株 CAL27 和 SCC25 的增殖。Agarwal 等6发现葡萄籽多酚(G
6、SP, 10 g/ml 100 g/ml, 2 天6 天)可呈时间和剂量依赖性显著抑制 DU145 细胞生长。与对照组相 比，50、75 和 100 g/ml GSP 作用 2 天可分别引起 27%、39%和 76%的细胞抑制率； 10 g/ml100 g/ml GSP 作用 4 天和 6 天对应的细胞抑制率分别为 28%97%和 12%98%。Vayalil 等7发现， GSP(5 g/ml80 g/ml)可呈剂量依赖性抑制 DU145 细 胞增殖(抑制率为 15%100%)，20 g/ml80 g/ml GSP 可使细胞活力下降 30%80%。 Meeran 等8采用 5 g/ml100
7、g/ml 的 GSP 作用于人表皮样癌 A431 细胞株，体外分 别培养 24、48 和 72 小时，结果发现 GSP 也可呈剂量依赖性抑制 A431 细胞增殖(抑 制率为 13%89%)。 本实验研究发现，12.5、25、50、100 和 200 g/ml GSPE 作用细胞 24 小时后，在 一定浓度范围内，GSPE 可呈剂量依赖性抑制人膀胱癌 BIU87 细胞生长，但对正常人 原代皮肤成纤维细胞生长无明显抑制作用。50、100 和 200 g/ml GSPE 对应的 BIU87 细胞的平均抑制率分别为 13.02%、31.82%和 48.58%，与上述研究结果大致相似。说 明在人膀胱癌细
8、胞中，GSPE 同样具有抑制肿瘤细胞生长的作用。本实验结果发现， 同浓度的 GSPE 对正常人皮肤成纤维细胞无生长抑制作用，表明其抑制细胞生长的效 应在一定浓度范围内可能是肿瘤特异性的。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 23 本实验结果表明， 在一定浓度范围内， GSPE 可呈剂量依赖性抑制人膀胱癌 BIU87 细胞生长，说明 GSPE 可能具有潜在的抗膀胱癌作用。因其抑制膀胱癌 BIU87 细胞生 长的形式和机制尚不明了，仍需进一步的研究。因 50、100 和 200 g/ml GSPE 可明显 抑制 BIU87 细胞生长，却对正
9、常细胞无抑制作用，故我们选取 50、100 和 200 g/ml 作为后续研究的实验浓度。 1：对照组 200 2：50 g/ml GSPE 组 200 3：100 g/ml GSPE 组 200 4：200 g/ml GSPE 组 200 (表现为随 GSPE 浓度增高，BIU87 细胞变圆，周缘毛糙细胞增多，细 胞贴壁能力下降，对照组细胞形态未见明显变化。) 图 1 GSPE 作用 24 h 对 BIU87 细胞形态改变的影响 12 34 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 24 1：对照组 100 2：50 g/ml GSPE 组
10、 100 3：100 g/ml GSPE 组 100 4：200 g/ml GSPE 组 100(各浓度组间细胞形态无明显差别) 图 2 GSPE 作用 24 h 对人原代皮肤成纤维细胞形态改变的影响 1 3 2 4 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 25 参考文献 1 司徒镇强, 吴军正. 细胞培养M. 第 1 版. 西安：世界图书出版公司, 1994, 72-73. 2 Busserolles J, Gueux E, Balasinska B, et al. In vivo antioxidant activity of proc
11、yanidin-rich extracts from grape seed and pine (Pinus maritima) bark in rats. Int J Vitam Nutr Res, 2006, 76(1): 22-27. 2 Llopiz N, Puiggros F, Cespedes E, et al. Antigenotoxic effect of grape seed procyanidin extract in Fao cells submitted to oxidative stress. J Agric Food Chem, 2004, 52(5): 1083-1
12、087. 3 吕丽爽, 曹栋. 葡萄籽中低聚原花青素的抗氧化性的研究. 食品科技, 2000, 4: 41-42. 4 Ye X, Krohn RL, Liu W, et al. The cytotoxic effects of a novel IH636 grape seed proanthocyanidin extract on cultured human cancer cells. Mol Cell Biochem, 1999, 196(1-2): 99-108. 5 Chatelain K, Phippen S, McCabe J, et al. Cranberry and Grap
13、e Seed Extracts Inhibit the Proliferative Phenotype of Oral Squamous Cell Carcinomas. Evid Based Complement Altern Med, 2008, 10.1093/ecam/nen047. 6 Agarwal C, Sharma Y, Agarwal R. Anticarcinogenic effect of a polyphenolic fraction isolated from grape seeds in human prostate carcinoma DU145 cells: m
14、odulation of mitogenic signaling and cell-cycle regulators and induction of G1 arrest and apoptosis. Mol Carcinog, 2000, 28(3): 129-138. 7 Vayalil PK, Mittal A, Katiyar SK. Proanthocyanidins from grape seeds inhibit expression of matrix metalloproteinases in human prostate carcinoma cells, which is
15、associated with the inhibition of activation of MAPK and NFB. Carcinogenesis, 2004, 25(6): 987-995. 8 Meeran SM, Katiyar SK. Grape seed proanthocyanidins promote apoptosis in human epidermoid carcinoma A431 cells through alterations in Cdki-Cdk-cyclin cascade, and caspase-3 activation via loss of mi
16、tochondrial membrane potential. Exp Dermatol, 2007, 16(5): 405-415. 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 26 第二部分 葡萄籽提取物原花青素对人膀胱癌 BIU87 细胞周期 的影响及其机制探讨 1 材料与方法 1.1 药物及试剂药物及试剂 (1) RPMI 1640 培养基(美国 Gibco 公司) (2) 胎牛血清(杭州四季青公司) (3) 胰蛋白酶(美国 Promega 公司) (4) 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA，美国 Sigma 公司) (5) 青霉素(北京中杉生物技术公司) (6) 链霉素(北京中杉生物技术公司) (7) 葡萄籽提取物原花青素(GSPE，纯度95%，南京青泽医药科技有限公司，批 号：QZ20070118） (8) 碘化丙啶(PI，美国 Sigma 公司) (9
