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1、上海交通大学 硕士学位论文 药物干预对DM大鼠血管COX-2表达的影响 姓名：杨华 申请学位级别：硕士 专业：内科学（内分泌与代谢病） 指导教师：陆颖理 20090401 中文摘要中文摘要 目的：(1)探讨糖尿病大血管中 COX-2 介导的炎症情况；(2)探讨阿司匹林，强的 松及雅施达对糖尿病大鼠大血管组织中 CO X -2表达的影响，为糖尿病大血管病 变的临床药物治疗提供实验依据。 方法：将 2 5 只雄性 Sp r a g u e -Da wl e y ( SD) 大鼠随机分为正常对照组（A组） ， 糖尿病组( B组) ，阿司匹林治疗组( C 组) ，强的松治疗组( D 组) ，雅施达治疗
2、组( E 组) ，每组各 5 只。禁食 12小时后，B组、C 组、D 组、E组一次性腹腔注射链 脲佐菌素（s t r e p t o z o t o c in , STZ）6 0 mg / k g （用 0 . 1mo l/ L 的枸橼酸缓冲液新鲜 配制，PH 4. 2 ） ，A组仅注射等体积枸橼酸缓冲液。7 2 h后至少连续三天剪尾检 测血糖，以连续三次血糖16 . 7 mmo l/ L 为造模成功。各组于成模 3天后给药， C 组给予 1mg / k g / d阿司匹林生理盐水混悬液灌胃， D 组给予 1mg / k g / d强的 松生理盐水混悬液灌胃， E组给予 1mg / k g /
3、 d雅施达生理盐水混悬液灌胃，A 组和 B组给予等体积生理盐水灌胃。药物干预 10周后每组称体重、测血糖。取 腹主动脉， 一部分采用RT-PCR与REA LTI M E-PCR方法检测经药物干预后CO X -2 mRNA 的表达；另一部分固定后用电镜观察血管的病理组织学改变，用免疫组 化技术检测 CO X -2蛋白的表达水平。 结果： 1、注射 STZ7 2小时后，糖尿病组和三药物干预组大鼠血糖显著增高，与对照组 比较有统计学意义（p 0 . 0 5） 。与对照组比较糖尿病组大鼠体重减轻，有统计 学差异（p 0 . 0 5） 。 2 、电镜可见，与对照组比较，糖尿病组和三药物干预组大鼠内皮细胞
4、变性坏死， 且糖尿病对照组有明显弹力膜断裂。与糖尿病组相比，三药物干预组的上述病理 改变减轻。 3、免疫组化分析显示，对照组大鼠大动脉组织中有少量 CO X -2蛋白表达。10 周时，与对照组比较，糖尿病组和三药物干预组大鼠大动脉组织中 COX-2 蛋白表 达显著增加，有统计学意义（p 0 . 0 5） 。但三药物干预组中 CO X -2蛋白表达显 著低于糖尿病组，有统计学差异（p 0 . 0 5） 。 4、REAITIME-PCR 定量结果显示，与正常对照组比较，糖尿病组大鼠与三药物干 预组大鼠 CO X -2 mRNA的表达均显著升高，有统计学差异，P 16. 7mmo l / L，建模成
5、功。 继续喂养 10周至实验末，定期监测血糖和体重。 2 标本采集 10周后，将大鼠麻醉，打开胸腹腔，迅速剪取胸主动脉及腹主动脉约 6c m。 平均分成两段，一段放福尔马林中固定，另一段装进冷冻管，置于-8 0度液氮罐 中储存。 3 血管组织总 RNA的抽提和纯度鉴定 3. 1 实验器具与材料： （1） 移液枪：1ml、2 0 0 u l 、10 u l 9 （2 ） 吸头：1ml、2 0 0 u l 、2 0 u l （3） 吸头台：放置 1ml 吸头的一个，放置 2 0 0 u l 和 2 0 u l 的吸头一个 （4） EP管 1. 5ml、10 0 u l （5） 匀浆机 （6） 容量
6、瓶：10 0 0 ml （7） 盐水瓶：10 0 ml （8 ） 15ml 塑料管一个（配 75乙醇用） 3. 2 实验器具的处理与准备 （1） 塑料制品： （包括吸头、EP 管等） 将塑料制品逐个浸泡于 1DEPC 水 中（必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC 水）37过夜，然后送至高压 3 次， 后在 8 0 烘烤箱中烘干（或置于 37中 8小时左右烘干） ，试验前将枪头放入 吸头台。 （2 ） 玻璃制品： 先泡酸过夜，冲洗干净后，在 1DEPC 水中泡 8小时左右，37烘干，用蒙锡 纸包裹送至干烤 3次。 （3） 金属制品： （镊子等） 先洗干净，再送干烤 3次。 （不需要泡 DEPC
7、水） 3. 3 试剂配制和准备： （1） DEPC 水： 泡实验器具的 DEPC 水的配制： 10 0 0 ml 双蒸水中加 1mlDEPC， 放在10 0 0 ml 容量瓶中静置4 小时后备用。 配75乙醇的DEPC 水的配制： 10 0 ml 盐水瓶内装 40 ml 双蒸水，加 40 u l DEPC，37过夜，送至高压。 （2 ） 75乙醇（要在抽提时现配） ：用无水乙醇和 DEPC 水配制（DEPC 水: 无水乙醇1: 3） ，然后放于-2 0 备用。 10 （3） 异丙醇：放入棕色瓶 （4） 氯仿：放入棕色瓶 （5） Tr iz o l ：10 0 ml / 瓶 存放于 4 抽提时注
8、意事项： 全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污 染物。 3. 4 抽提步骤 ( 1) 匀浆化作用 从液氮中取出放置 3c m大鼠血管组织的冷冻管，先加 0 . 5ml 的 Tr iz o l 溶液， 再将匀浆机探头插入冷冻管，研磨组织后，倒入 1. 5ml EP管中，再在 EP管内加 入 0 . 5ml 的 Tr iz o l 溶液。颠倒混匀 10下，室温静置 5 分钟。 ( 2 ) 分离阶段 每 1ml Tr i z o l 中加 0 . 3ml 氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管 15 秒，使 其充分混匀，室温静置 5 分钟。后 12 0 0 0 r m
9、p离心 15 分钟。 ( 3) RNA的沉淀 将上层水相转入新的 1. 5ml EP管中（约 40 0 -50 0 u l ） ，加入 0 . 5ml 异丙醇，混 匀后放于-2 0 中 1 小时，后 12 0 0 0 r mp离心 10分钟。 ( 4) RNA的洗脱 小心倒掉上清，留取沉淀。加 1ml 现配的 75%的乙醇（预冷）振荡洗涤 RNA 沉淀一次，后 750 0 r mp离心 5 分钟。 ( 5) RNA的再溶解 小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约 30分钟，此时 RNA沉 淀变透明） 。注意不能让 RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性） 。再在 11 管中加 2
10、0 u l 的 DEPC 水溶解，在 55-60 下孵育 10分钟助溶。 ( 6) RNA的保存 提取的 RNA保存于-70 超低温冰箱中，或立即用于逆转录。 3. 5 . RNA纯度鉴定：将 RNA原液稀释 10 0倍后，放入紫外分光光度计的比色皿 中，读出 O D2 60 / O D2 8 0的比值，如在 1. 8 -2 . 0之间，说明 RNA纯度高。 4 逆转录 4. 1 准备工作 （1）移液枪：2 0 0 u l 、10 u l （2 ）吸头：2 0 0 u l 、2 0 u l （3）EP管 1. 5ml、10 0 u l （4）水浴箱 4. 2 实验器具的处理与准备 塑料制品：
11、（包括吸头、EP管等） 将塑料制品逐个浸泡于 1DEPC 水中 （必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC 水）37过夜，然后送至高压 3次，后在 8 0 烘烤箱中烘干（或置于 37中 8 小时左右烘干） ，试验前将枪头放入吸头台。 4. 3 试剂配制和准备： （1） DEPC 水： 泡实验器具的 DEPC 水的配制： 10 0 0 ml 双蒸水中加 1mlDEPC， 放在 10 0 0 ml 容量瓶中静置 4 小时后备用。逆转录中所用的 DEPC 水的配制： 10 0 ml 盐水瓶内装 40 ml 双蒸水，加 40 u lDEPC，37过夜，送至高压，后分装 到几个 1. 5ml EP管中，-2
12、 0 中保存备用。 （2 ）RT 中所需要的各种试剂 （3） 引物浓度计算方法： （新合成的引物的稀释） 假如终浓度为 X u M ( p mo l / u l ) 12 加 DEPC 水体积（u l ）（O D3310 0 0 0 0 0 ）/ （分子量X ） 4. 4 RT 时注意事项： 为避免 RNA酶污染，在 RT 中仍要佩戴一次性手套和口罩。 4. 5 用 A M V 逆转录酶进行 RT（10 u l 体积） ( 1) 准备 0 . 65ml EP管 ( 2 ) 加入 4. 5u l DEPC 水，1u l 引物，1u l 模板 RNA ( 3) 稍离心，10 0 沸水裕 1mi n
13、 ( 4) 加入 0 . 5u l d NTP，2 u l 5Bu f f e r ，1u l A M V 逆转录酶 ( 5) 稍离心，封口膜封口，42 水浴 90 作 RT ( 6) 10 0 沸水裕 3mi n灭活 A M V ( 7) 立即 PCR或-2 0 保存。 5 聚合酶链式反应( PCR) 5. 1 准备工作 （1）移液枪：2 0 0 u l 、10 u l （2 ）吸头：2 0 0 u l 、2 0 u l （3）吸头台：放置 2 0 0 u l 和 2 0 u l 的吸头一个 （4）EP管 1. 5ml、10 0 u l 5. 2 实验器具的处理与准备 塑料制品： （包括吸头
14、、EP 管等） 送至高压 3 次，试验前将枪头放入吸头 台。 5. 3 试剂配制和准备： ( 1) 双蒸水： 10 0 ml 盐水瓶内装 40 ml 蒸馏水， 送至高压， 后分装到几个 1. 5ml EP 管中，-2 0 中保存备用。 13 ( 2 ) PCR中所需要的各种试剂 5. 4 PCR时注意事项： 佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。 5. 5PCR步骤 ( 1) 准备 10 0 u l EP管 ( 2 ) 依次在管中加入： （30 u l 反应体系） d d H2O 17. 5u l ？ 10 mM d NTP 1u l ？ 10 PCR b u f f e
15、r 5u l ？ 2 5mM M g c l 2 （加之前要摇匀） 3u l ？ 上游引物 1u l ？ 下游引物 1u l ？ 模板 c DNA 1u l ( 3) 稍离心 ( 4) 10 0 沸水浴 1 分钟 ( 5) 趁热加入 Ta g酶 0 . 5u l （冰上操作） ( 6) 再加入 30 u l 液体石蜡封闭 ( 7) 10 0 0 0 r mp离心 1 分钟 ( 8 ) PCR条件 94 1mi n 58 50 s e c 72 1mi n 30 s e c 进行 40个循环，然后 72 10 mi n 完后 4保温。 14 ( 9) 10 0 0 0 r mp离心 5mi n
16、( 10 ) 将下层水相转入新的 0 . 65ml EP管中，-2 0 保存。 6 电泳鉴定 6. 1 准备工作 （1）移液枪：10 u l （2 ）吸头：2 0 u l （3）吸头台：放置 2 0 0 u l 和 2 0 u l 的吸头一个 （4）三角烧瓶：50 ml 一个 （5）琼脂糖 6. 2实验器具的处理与准备 ( 1) 塑料制品： （包括吸头等） 送至高压 3次，试验前将枪头放入吸头台。 （2 ）电泳板及电泳槽： ( 3) 用自来水冲洗干净备用 6. 3 试剂配制和准备： ( 1) 电泳缓冲液（TA E） ： 先配制 0 . 5mo l/ L, PH8 . 0的 EDTA溶液：将 37. 2 g EDTA -Na加入 160 ml 蒸馏 水中， 在搅拌器上剧
