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1、第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编动物实验 i nc a n i n ep e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l Sb yR T - P C R J J V e t M e d S c i 1 9 9 5 ，5 7 ：4 3 9 4 4 5 1 0 D a h lL ，J e n s e nT H ，G o t t s c h a l c kE ，e ta 1 I m m u n i z a t i o nw i t hp l a s m i dD N Ae n c o d i n gt h eh e m a g g
2、 l u t i n i n a n dt h en u c l e o p r o t e i nc o n f e r sr o b u s tp r o t e c t i o na g a i n s tal e t h a lc a n i n ed i s t e m p e rv i r u s c h a ll e n g e J V a c c i n e 2 0 0 4S e p9 ：2 2 ( 2 7 2 8 ) ：3 6 4 2 8 1 1 3C h e r p i l l o dP ，T i p o l dA ，G r i o t - W e n kM ，e ta 上
3、D N Av a c c i n ee n c o d i n gn u c l e o c a p s i da n ds u r f a c e p r o t e i n so fw i l dt y p ec a n i n ed i s t e m p e rv i r u sp r o t e c t si t sn a t u r a lh o s ta g a i n s td i s t e m p e r J V a c c i n e2 0 0 0 ：1 8 ( 2 6 ) ：2 9 2 7 3 6 1 2 陈培富，郭爱珍，陆承平犬瘟热病毒南京分离株的生物学特性鉴定 J
4、中国兽医学报，2 0 0 0 ， 2 0 ( 3 ) ：2 3 1 2 3 4 1 3 萨姆布鲁克J ，弗里奇E F ，曼尼阿蒂斯T 著( 金冬雁，等译) 分子克隆实验指南 M 第二版，北京： 科学出版社1 9 9 2 ：8 6 0 - 8 6 2 1 4 E K k o m m o n e nC ，S i h v o n e nL ，P e k k a n e nK ，e ta 上O u t b r e a ko f fc a n i n ed i s t e m p e ri nv a c c i n a t e dd o g s i nE n g l a n d J 1 9 9 7 ，1
5、 4 1 ：3 8 0 3 1 5 G r i o tC ，M o s e rC ，C h e r p i l l o dP ，e ta 1 E a r l yD N Av a c c i n a t i o no fp u p p i e sa g a i n s tc a n i n ed i s t e m p e r i nt h ep r e s e n c eo fm a t e r n a l l yd e r i v e di m m u n i t y J V a c c i n e 2 0 0 4J a n2 6 ：2 2 ( 5 - 6 ) ：6 5 0 4 1 6 A
6、l a nHR o s e n b e r g ，B a r b a r aN L a d eD z o s h a nC h u i ，e ta 1 V e c t o r sf o rS e l e c t i v ee x p r e s s i o no f c l o n e dD N A sb yT 7R N AP o l y m e r a s e J G e n e ，1 9 8 75 6 ：1 2 5 1 3 5 1 7 隋广超，胡美清影响大肠杆菌中外源基因表达的冈素 J 生物化学与生物物理进展，1 9 9 4 ， 2 1 ( 2 ) ：1 2 8 1 3 2 药品及生物制品
7、热原检查 薛敬礼 ( 郑州大学实验动物中心，4 5 0 0 0 1 ) 一百多年前，在西方医学的发展史上，一个重大的进步就是注射给药方式的创立。毫无疑 问，它在人类与疾病作斗争的过程中起着非常重要的作用。但是无论过去还是现在，在临床上 常因使用输注药液引起病人发热、体温升高( 可升至4 0 ) 、冷感、寒战、恶心、呕吐、头痛、 腰及四肢关节痛、肤色灰白、白细胞下降、血管通透性增强、严重者出现昏迷、虚脱甚至休克、 死亡等，这一系列症状称为热原反应，所有能引起热原反应的物质称为热原。热原质可引起机 体炎症反应，导致发热和血管效应。 因此对那些非肠道途径( 如：注射、输注) 服用的药物进行热原检测，
8、是确保药品质量和安全用 药必不可少的质量控制手段。 1热原质的概念及分类 1 1 热原质的概念 药品和生物制品在生产过程中可能被细菌或其他物质所污染，人类在使用了这样的生物制 品后可引起机体的致热反应，即热原反应。引起机体致热反应的物质称为热原质( P y r o g e n ) ，他 是微生物的代谢产物。 1 2 热原质的分类热原质可分为外源性和内源性两大类： 1 2 1 外源性的热原质： 4 2 4 动物实验 第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编 内毒素( E n d o t o x i n ) ：即革兰阴性细菌( G 一菌) 细胞壁的脂多糖( 1 i p o p 0 1 y s a
9、c c h a r i d e s ，L P S ) 。 L P S 诱导发热的能力很强。除L P S 外，证实革兰阳性细菌( G + 菌) 感染也可引起机体发热，如从粪 链球菌( G + 菌) 等2 0 多个菌属的细菌壁获得的脂磷壁酸质类( 1 i p o t e i c h o i c a c i d s ) 。另外，病毒、 寄生虫和真菌的某种组分、类固醇、聚核苷酸和某些加到药品制剂中的合成性添加剂等，都可能 产生热原，引起机体的炎症和发热反应。因此，L P S 和其他发热诱导物( 或成分) 统称为外原性热 原质。但在生物制品最常见、最主要的热原质是L P S ( 其结构见下) 。 1 2
10、 2 内源性热原质： 机体内的周围血细胞与来自外界的致热物质接触而相互作用，释放出信息物质，将信号传递 到下丘脑而引起体温升高。这些体液传递介质包括：白细胞介素1 ( I L lB ) 、白细胞介素6 ( I L 6 ) 、 a 肿瘤坏死因子( T N F ) 和前列腺素( P G E 2 ) 。 1 3热原的组成和性质 I 3 1 热原的组成 热原是微生物的一种内毒素，存在于细菌的细胞膜和固体膜之间。内毒素是由磷脂、脂多 糖和蛋白质所组成的复合物，其中脂多糖( 1 i p 6 p 0 1 y s a c c h a r i d e ) 是内毒素的主要成分，具有特 别强的热原活性，因而大致可以
11、认为内毒素= 热原= 脂多糖。脂多糖的化学组成因菌种不同而异， 从大肠杆菌分出来的脂多糖中有6 8 6 9 的糖，1 2 1 3 的类脂化合物，7 的有机磷和其它一 些成分。 热原的分子量一般为l O x l 0 5 左右。 1 3 2 热原的性质 ( 1 ) 耐热性热原在6 0 c ) 口n 热l h 不受影响，1 0 0 也不会发生热解，在1 8 0 。C 3 - 4 h ，2 5 0 3 0 4 5 分钟或6 5 0 l m i n 可使热原彻底破坏。 ( 2 ) 滤过性热原体积小，约在1 5 舳之间，故一般滤器均可通过；但活性炭可以吸附热 原。 ( 3 ) 水溶性热原能溶于水。 ( 4
12、 ) 不挥发性热原本身不挥发，但在蒸馏时，往往可随水蒸汽雾滴带入蒸馏水。 ( 5 ) 热原能被强酸、强碱破坏，也能被强氧化剂如高锰酸钾或过氧化氢所钝化，超声波也能 破坏热原。 ( 6 ) 热原具有累加的性质一批产品出现热原，如不查出隐患，继续生产，家兔升温数 值会一批高于一批。 1 4污染热原质的途径 1 4 1从溶剂中带入这是注射剂出现热原的主要原因。 1 4 2从原料中带入 1 - 4 3从容器、用具、管道和装置等带入 1 4 4 制备过程中的污染 1 4 5 从输液器带入 1 - 5热原质的去除方法 1 5 1高温法2 5 0 加热3 0 r a i n 以上 1 5 2 酸碱法玻璃容器
13、、用具还可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，可将热 原破坏； 1 5 3 吸附法活性炭对热原有较强的吸附作用， 0 5 。 1 5 4 离子交换法 1 5 5 凝胶滤过法分子筛 1 5 6 反渗透法、超滤法 同时有助滤脱色作用。常用量为0 1 4 2 5 第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编动物实验 1 5 7 生产过程避免微生物的污染、繁殖 2检查热原的方法 在欧洲及大多数国家的药典都明确规定了热原质检测的两个实验系统： 体内的家兔热原质试验和体外的“细菌内毒素试验”或称“L A L 试验”。“L A L ”是 L i m u l u sA m o e b o c y t eL y
14、s a t e ( 鲎阿米巴样细胞裂解物) 的缩写，它是大眼水蚤属h o r s e s h o e 蟹 状鲎血细胞( 阿米巴样细胞) 的提取物。人血试验：为达到减少动物的使用，进一步完善体外替 代方法的目的，国外许多科学家致力于热原质检测的另一体外替代试验的研究一人血试验。 2 1 细菌内毒素试验： 已有近2 0 年的历史，它是家兔热原试验的一种体外替代方法。其原理是G _ 菌的细胞壁外 膜上的L P S 和阿米巴样细胞内凝固酶的反应可以导致裂解物形成凝块。这种凝集现象可以作为 指示标志，说明受试品中存在有内毒素。用鲎法检查细菌内毒素时，必须先通过干扰实验，了解 待测供试品对凝集反应是否有增
15、强或抑制作用，从而确定该品种能否用鲎试剂检查。一般情况 下大多数药品直接测定时往往会产生干扰作用，故须排除干扰后再进行测定。排除干扰最常用 也是最简便的方法是稀释法。 细菌内毒素试验方法有：凝胶法、浊度法、显色底物法、免疫学法等。其中经典方法是凝 胶法( 试管凝胶试验) ，目前各国药典收载的细菌内毒素检查法均包含凝胶法。 2 2 家兔热原试验： 1 9 1 2 年有人提出家兔的热原试验，该方法在1 9 2 3 1 9 2 5 年期间得到进一步的发展。后来美 国食品药物管理局( F D A ) 、美国国家卫生研究院( N I H ) 和1 4 家药厂协作研究，并于1 9 4 2 年首次 收载于美
16、国药典1 2 版( u s P x ) ；半个世纪以来一直作为法定热原检查法为各国药典所采用。中 国药典1 9 5 3 年版开始收载。各国药典方法基本相同。它是将一定剂量的受试品经静脉途径注入 家兔体内，在规定的时间内观察家兔体温升高情况，以判定受试品中所含热原质的限量是否符 合规定的一种方法。 2 3 人血试验 设计则是完全模拟人体内反应，其原理是：当机体免疫系统的细胞( 主要是单核细胞和巨噬 细胞) 与热原质接触后，能够释放出引起机体发热反应的内源性致热物质一白细胞介素1p ( I L1 B ) ，I L1B 作用于大脑的下丘脑体温调节中枢，引起发热反应。通过利用血清学试验( 如E L I S A ) 对I L11 3 进行检测，
