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1、华中科技大学 博士学位论文 药用辅料抑制肠道P-糖蛋白药泵作用研究 姓名：黄建耿 申请学位级别：博士 专业：药理学 指导教师：李高 20080501 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 10 缩 略 语 缩 略 语 (Abbreviations) MDR Multidrug Resistance 多药耐药 P-gp P-Glycoprotein P-糖蛋白 ABC ATP-binding cassette ATP结合盒 Cel Celiprolol 塞利洛尔 Ver Verapamil 维拉帕米 Gan Ganciclovir 更昔洛韦
2、 F-68 Pluronic F68 普朗尼克 PEG Polyethylene glycol 聚乙二醇 T Tween 吐温 S-40 Polyoxyethylene40 stearate 聚氧乙烯(40)单硬脂酸酯 HP-CD Hydroxypropyl-cyclodextrin 羟丙基-环糊精 PVP Povidone 聚维酮 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 AP Apical 肠腔侧 BL Basolateral 基底侧 ALP Alkaline phosphatase 碱性磷酸酶 TEM Transmission electron microsc
3、ope 透射电子显微镜 TEER Transepithelial electrical resistances 跨膜电阻值 Papp apparent permeation coefficient 表观渗透系数 ER Efflux ratio 外排率 PBS Phosphate buffered saline 磷酸缓冲液 HPLC High Perfromance Liquid Chromatography 高效液相色谱 MTT (3-(4,5-dimethylthiazolzyl)-2,5- diphenyl tetrazo-diumbromide 四甲基偶氮唑盐 UV Ultraviole
4、t Spectrogram 紫外光谱 ig intragastric gavage 灌胃给药 独创性声明 独创性声明 本人郑重声明， 本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总 结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表 或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送
5、交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人 授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 1 药用辅料抑制肠道药用辅料抑制肠道 P-糖蛋白药泵作用研究糖蛋白药泵作用研究 摘 要 摘 要 P-糖蛋白 （P-glycoprotein, P-gp） 是一种
6、 170kDa 大小的 ATP 能量依赖型的外排蛋 白，即“药物溢出泵” ，能将吸收进入浆膜侧的药物重新泵回粘膜侧，导致药物吸收 减少，生物利用度降低。抑制 P-糖蛋白的药物溢出泵作用可有效地提高某些口服药物 的吸收率，降低肝、肾清除率。许多早期的外排泵抑制剂如维拉帕米、普罗帕酮等， 会产生一些不可接受的毒副作用，而限制其临床应用。因此，寻找一些无毒、无药理 活性的逆转剂成为国内外药剂学者关注的新焦点。本论文以药用辅料为研究对象，选 用塞利洛尔为 P-gp 探针药物，采用 Caco-2 细胞单层膜模型、离体小肠外翻模型、在 体小肠灌流模型与原位小肠吸收模型考察 P-gp 药泵作用在塞利洛尔跨膜
7、转运与透膜 吸收中发挥的作用，比较不同药用辅料种类及不同浓度对 P-gp 药泵作用的抑制强度， 希望筛选出具有较强 P-gp 抑制作用的辅料。 Caco-2 细胞模型已经作为一种简便、高效的体外模型广泛应用于口服药物吸收机 制及候选药物的高通量筛选。本实验采用 Caco-2 细胞模型，利用测定跨膜电阻值和酚 红透过试验检验其完整性。完整性检测合格后可用于探针药物塞利洛尔跨膜转运实 验，以维拉帕米为阳性对照，利用 HPLC 法测定药物跨膜转运量，计算跨膜转运参数 表观渗透系数 Papp与外排率 ER 值来评价药用辅料对 Caco-2 细胞膜上 P-gp 外排功能 的抑制作用。塞利洛尔在 Caco
8、-2 细胞单层膜 APBL 方向的 Papp值远小于 BLAP 方向的 Papp值，阳性 P-gp 逆转剂维拉帕米使塞利洛尔 APBL 方向跨膜转运的 Papp 值增加 30%，BLAP 方向的 Papp值降低 50%，说明 P-gp 在塞利洛尔跨膜转运过程 中发挥重要作用。 辅料 F-68， Cremophor EL， Cremophor RH40， T-80， PEG200， PEG400， PEG4000，-CD，HP-CD，PVP K30，TritonX 100，S-40 可增加塞利洛尔 APBL 方向跨膜转运的Papp值并降低BLAP方向的Papp值； T-20， T-60， PEG
9、1000， PEG2000， PEG6000，PVP K10 随浓度的提高可增加塞利洛尔 APBL 方向跨膜转运的 Papp值并 降低 BLAP 方向的 Papp值；Lecithin 对塞利洛尔 APBL 方向跨膜转运的 Papp值与 BLAP 方向的 Papp值均无明显影响；SDS 具有较大的细胞毒性使塞利洛尔 APBL 方向跨膜转运的 Papp值与 BLAP 方向的 Papp增加异常。进一步通过外排率 ER 值评 基金项目:国家自然科学基金资助项目（30572265） ；湖北省卫生厅科研基金项目（JX2B04） 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士
10、学 位 论 文 2 价辅料抑制 P-gp 作用强度，结果表明 F-68、Cremophor EL、Cremophor RH40、T-20、 T-60、T-80、PEG200、PEG400、-CD、HP-CD、S-40 等可显著抑制塞利洛尔细胞 膜外排方向转运，在 Caco-2 细胞模型中具有明显抑制 P-gp 药泵作用。 大鼠离体外翻小肠吸收与外排模型分别选择大鼠小肠空肠段与结肠段进行研究。 以维拉帕米作阳性对照，考察 F-68、Cremophor EL、Cremophor RH40、T-60、T-80、 PEG200、PEG400、PEG1000、HP-CD、S-40 十种药用辅料对塞利洛尔
11、从外翻小肠 囊的粘膜层向浆膜层（MS） 、浆膜层向粘膜层（SM）转运情况，评价低中高辅料 浓度逆转小肠 P-gp 药泵作用对塞利洛尔促吸收与抑制外排作用。 离体外翻小肠吸收模 型实验结果表明 F-68、Cremophor RH40、PEG400、T-80 具有较强的促吸收作用； Cremophor EL、 T-60、 PEG200、 PEG1000、 S-40 随浓度提高促吸收作用增强； HP-CD 对药物 MS 吸收影响不大。离体外翻小肠外排模型实验结果表明 F-68、Cremophor EL、Cremophor RH40、T-60、T-80、PEG200、PEG400、S-40 具有较强的
12、抑制外排作 用； PEG1000 与 HP-CD 随浓度提高抑制外排作用增强。 大鼠在体小肠灌流模型不仅用于评价药物及其制剂口服吸收情况，还广泛应用于 生物膜的转运机制研究。本文选用该模型研究 F-68、Cremophor EL 等 10 种药用辅料 对在体小肠灌流后塞利洛尔吸收的影响。结果表明 F-68、Cremophor EL、Cremophor RH40、T-60、T-80、PEG200、PEG400、S-40 可显著提高药物吸收速率常数 ka与有 效透过系数 Peff，由于塞利洛尔为 P-gp 典型底物，因此推断药物促吸收作用与抑制 P-gp 外排作用密切相关；但辅料 PEG1000
13、与 HP-CD 对塞利洛尔在体肠灌流吸收无 明显促进作用。 在 Caco-2 细胞模型、离体与在体动物模型研究基础上，进一步采用整体动物模 型原位小肠吸收实验考察 F-68、Cremophor EL 等 10 种药用辅料对塞利洛尔十二指肠 处给药后透膜吸收的影响。采用 HPLC 法测定血药浓度，DAS 软件计算药代动力学参 数，评价药用辅料对 P-gp 抑制作用及促进塞利洛尔吸收的影响。从药时曲线结果分 析，给予 F-68、Cremophor EL、Cremophor RH40、T-80、PEG200、PEG400、S-40 后 塞利洛尔血药浓度均有不同程度的提高，但给予辅料 T-60、PEG
14、1000、HP-CD 后塞 利洛尔药时曲线与阴性对照组相当，远低于维拉帕米阳性对照组水平。从药代动力学 参数分析，给予药用辅料后药物半衰期 t1/2有所延长，清除率 CL 降低。同时药时曲 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3 线下面积 AUC 统计分析结果表明： F-68、 Cremophor RH40、 PEG200、 PEG400、 S-40 高浓度组与 Cremophor EL、T-80 中高浓度组可明显提高塞利洛尔药时曲线下面积 AUC，从而促进药物吸收；同时上述各辅料其它浓度组均可在一定程度上提高药物 AUC，但统计学分析
15、无显著性差异。辅料 T-60、PEG 1000 与 HP-CD 在整体动物模 型中对塞利洛尔各参数几乎无影响，提示上述三种辅料不影响药物吸收过程。 选择四种具有抑制P-gp药泵作用的辅料逆转剂F-68、 Cremophor EL、 T-80、 PEG400 考察其对大鼠小肠 P-gp 表达的影响， 分别采用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒、 运用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳与凝胶图像分析技术、免疫印迹技术分析逆转剂与 P-gp 表达之 间的关系。单独给予药物塞利洛尔或联合给予塞利洛尔与辅料逆转剂均可促进 P-gp 表达，但发现辅料逆转剂与维拉帕米可明显诱导外排蛋白的进一步表达。 选取更昔洛韦作为
16、实验药物， 考察辅料逆转剂 F-68、 Cremophor EL、 T-80、 PEG400 对更昔洛韦在Caco-2细胞模型及原位小肠吸收实验模型中跨膜转运与透膜吸收情况， 评价辅料逆转剂抑制 P-gp 作用对提高更昔洛韦口服吸收的影响。在 Caco-2 细胞模型 中维拉帕米与辅料逆转剂可提高更昔洛韦 APBL 方向表观渗透系数 Papp，降低 BLAP 方向的表观渗透系数 Papp，从而使外排率 ER 值明显下降，统计分析结果表 明：维拉帕米组及辅料逆转剂各中高浓度组的外排率 ER 值与阴性对照组间有显著性 差异，辅料逆转剂其它浓度组也均使更昔洛韦外排率降低，但无统计学意义。在原位 小肠吸收实验中给予辅料逆转剂 F-68、Cremophor EL、T-80、PEG400 后更昔洛韦血 药浓度均有一定程度的提高， 其中 Cremophor EL 低中浓度组、 T-80 低浓度组、 PEG400 低浓度组对药时曲线下面积有
