《苹果醇酰基转移酶基因mdaat2启动子克隆与功能鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《苹果醇酰基转移酶基因mdaat2启动子克隆与功能鉴定（67页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、山东农业大学 硕士学位论文 苹果醇酰基转移酶基因（MdAAT2）启动子克隆与功能鉴定 姓名：沈瑾 申请学位级别：硕士 专业：植物学 指导教师：李德全;李大鹏 20090515 山东农业大学硕士学位论文 苹果醇酰基转移酶基因( ? I 删4 刀) 启动子克隆与功能 鉴定J 正，一 捅要 酯类挥发性物质是构成苹果特征香气最重要的成份，目前针对醇酰基 转移酶基因( 删砑) 调控机理的研究，仅限于果实成熟过程中乙烯的 调控作用及与果实品质的关系，而信号物质诱导该基因表达的调控机制尚 未见报道。本文克隆了苹果醇酰基转移酶基因( 膨栩4 砣) 的启动子，并 将其与G U S 基因融合，通过农杆菌介导法转化
2、烟草，对启动子进行了组 织化学分析和调控分析，主要结果如下： 1 删龙启动子序列的克隆 将金帅苹果叶片的基因组D N A 稀释后做模板，利用t a i l P C R 得到 7 2 5 b p 左右的特异产物。以7 2 5 b p 为模板，t a i l P C R 得到1 0 3 2 b p 左右的特 异产物。将7 2 5 b p 和1 0 3 2 b p 序列拼接出1 5 7 2 b p 的序列( 基因银行注册号： E F 4 5 9 6 9 3 ) 。以1 5 7 2 b p 为模板，在编码区A T G 的5 端上游设计特异引物， 以基因组D N A 为模板进行P C R 反应，扩增出1
3、 2 0 1 b p 的特异产物。将扩 增产物与p M D l 8 - T 载体连接，转化大肠杆菌。利用P C R 和酶切鉴定阳性 转化子。 2 M d A A T 2 启动子克隆片断的序列比对 把7 2 5 b p 和1 0 3 2 b p 序列进行比对发现，在重合区域，除了5 个碱基 有所不同，其余完全吻合，因此得到了两段序列拼接以后的全序列 1 5 7 2 b p 。构建表达载体时，去除编码区扩增出1 2 0 1 b p 启动子序列。将 1 5 7 2 b p 与1 2 0 1 b p 比对，两段序列基本吻合，个别碱基有所不同。 3 M d A A T 2 启动子转录起始位点的确定 将e
4、 D N A 序列与1 2 0 1 b p 比对，得到转录起始位点为黑色方框中5 端 第一个字母A 。确定了转录起始位点，就可以对启动子序列进行标号，将 转录起始位点标为+ 1 ，5 上游以负号表示。 4 ? I 纪4 4 乃启动子与G U S 基因融合 引入3 0 0 b p 左右带有印口I 酶切位点的片段，将连有此片段的p M D 载 苹果醇酰基转移酶基因( M d A A T 2 ) 启动子克隆与功能鉴定 体和p B I 载体用B a m H I 和H i n d l I I 酶切连接。这样，改造后的p B l l 2 1 表 达载体就引入了S p e I 酶切位点。用B a m H I
5、 和S p e I 将长度为1 2 0 1 b p 的 M d A A T 2 启动子从克隆载体中切下，定向替换p B l l 2 1 质粒的3 5 S 启动子， 与G U S 基因连接，获得M d A A T 2 启动子的植物双元表达载体，转化大肠 杆菌，利用P C R 和酶切鉴定阳性转化子，提取p B I 质粒，转化农杆菌。 5 含有M d A A T 2 启动子转基因烟草的获得 将上述表达载体转化农杆菌，然后转化烟草。为了进一步鉴定抗卡那 霉素烟草植株确实为转基因植株，提取转基因烟草叶片的基因组，根据 p B l l 2 1 载体中抗卡那霉素的基因设计专一引物，对转基因烟草进行P C R
6、 检测。P C R 反应程序为：9 4 ，预变性5 分钟；9 4 ，4 0 秒：5 8 ，4 0 秒：7 2 ，9 0 秒；7 2 ，l O 分钟；共3 5 个循环。 6 M d A A T 2 启动子的G U S 定量分析和组织化学分析 取M d A A T 2 转基因烟草的根、茎、叶和花进行G U S 染色和G U S 定量 活性分析，发现M d A A T 2 启动子可以高效驱动G U S 基因在烟草的花器官 中表达，而在叶、茎和根中几乎检测不到G U S 活性。对烟草的花粉囊、 花粉、柱头、胚乳、种子进行G U S 染色分析，发现主要在花粉和花粉管 中高效表达。分别用M e J A 、
7、S A 和E T H 处理转基因烟草结果相同，且处 理后蓝色更深更明显。这说明M d A A T 2 启动子是花粉和花粉管特异表达 启动子。 7 M d A A T 2 启动子的调控分析 利用P C R 技术对1 2 0 1 b p 启动子进行5 端有目的的缺失，分别扩增出7 8 3 b p 、7 1 6b p 、3 7 0b p 和2 9 7 b p 的片段。用同样的方法进行3 端有目的的缺失， 分别扩增出1 0 3 9 b p 、6 8 1 b p 、2 5 9 b p 和2 2 7 b p 的片段。将所得P C R 产物分别 克隆多 p M D l 8 - T 载体中，筛选阳性克隆，测序
8、后发现所选的8 个阳性克隆 都含有M d A A T 2 启动子中的相应序列，分别构建植物表达载体。 关键词：苹果；M d A A T 2 ；启动子克隆；功能鉴定 l l 山东农业大学硕士学位论文 C l o n i n ga n d F u n c t i o n a li d e n t i f i c a t i o no fM d A A T 2 P r o m o t e r A b s t r a c t V o l a t i l ee s t e r sa r ei m p o r t a n ta r o m a t i cc o m p o n e n t so fa p
9、p l ef r u i t A t p r e s e n t ，t h er e s e a r c ho fa l c o h o la c y l t r a n s f e r a s eg e n e ( M d A A T 2 ) r e g u l a t i o na n d c o n t r o lm e c h a n i s mi sl i m i t e dt ot h ee t h y l e n ei nt h ep r o c e s so ff r u i tr i p e n i n g a n dt h er e l a t i o n s h i pb
10、 e t w e e ne t h y l e n ea n df r u i tq u a l i t y T h er e g u l a t o r y m e c h a n i s mo ft h es i g n a l i n d u c e dM d A A T 2g e n ee x p r e s s i o nh a sn o tb e e n r e p o r t e d I nt h i ss t u d y , w ec l o n e dt h ep r o m o t e r so fM d d A T 2a n dt h e nf u s e d t h e
11、 mw i t I lG U S H i s t o c h e m i c a la n a l y s i sa n dc o n t r o la n a l y s i sw e r ec a r r i e do u t t h r o u g hA g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o no ft o b a c c o T h em a i nr e s u l t s a r ea sf o l l o w s ： 1 C l o n i n go fM d A A T 2p r o m
12、 o t e rs e q u e n c e s D i l u t e dg e n o m i cD N Ao fG o l d e nD e l i c i o u s a p p l e l e a v e sa st h e t e m p l a t e ，a b o u t7 2 5 b ps p e c i f i cp r o d u c t w e r eo b t a i n e di nt h eu s eo f t a i l - P C R T h e na b o u t10 3 2 b ps p e c i f i cp r o d u c tw e r eo
13、 b t a i n e du s i n g7 2 5 b pa sa t e m p l a t e 7 2 5 b p a n d10 3 2 b ps p e c i f i cp r o d u c ts p l i c eo u tt h es e q u e n c eo f 15 7 2 b p ( G e n B a n k ：N o E F 4 5 9 6 9 2 ) 10 3 2 b ps p e c i f i cp r o d u c tW a so b t a i n e d w h i c hu s e d15 7 2 b pa sat e m p l a t e
14、a n dW a sd e s i g n e ds p e c i f i cp r i m e r si nt h e5 e n do ft h eu p p e rr e a c h e so ft h ec o d i n gr e g i o nA T GP C Rr e a c t i o nw a sc a r r i e d o u tw i t hg e n o m i cD N Aa sat e m p l a t ea n da m p l i f i e dt h es p e c i f i cp r o d u c to f 1 2 0 1 b p W ec o n
15、 n e c t e dt h ea m p l i f i e dp r o d u c t i o n 、i t l lp M D l 8 一Tv e c t o r , t r a n s f o r m e dt h ev e c t o ri n t oEc o i la n di d e n t i f i e dp o s i t i v et r a n s f o r m a n t sb y P C Ra n dr e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o n 2 S e q u e n c ea l i g n m e n
16、 to ft h e 朋删记p r o m o t e rc l o n i n gf r a g m e n t T h es e q u e n c ea l i g n m e mb e t w e e n7 2 5 b pa n d10 3 2 b ps h o w st h a ti nt h e o v e r l a pr e g i o n ，i na d d i t i o nt of i v ed i f f e r e n tb a s e s ，t h er e s ta r ee x a c t l yt h es a m e S ow eg o tt h es p l i c i n g s e q u e n c e 15 7 2 b p D u r i n gt h ec o n s t r u c t i o no f I I I 苹果醇酰基转移酶基因( M d d A T 2 ) 启动子克隆与功能鉴定 e x p r e s s i o nv e c t o r ,
