莠去津与光合细菌对中华锯齿米虾免疫力的影响

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1、 密 级： 学校代码：10075 分类号： 学 号：20081171 农学硕士学位论文 莠去津与光合细菌对中华锯齿米虾免疫 力的影响 学 位 申 请 人 ： 刘涛 指 导 教 师 ： 康现江 教授 学 位 类 别 ： 农学硕士 学 科 专 业： 水产养殖 授予学位单位： 河北大学 答 辩 日 期： 二一二年五月 Classified Index: CODE: 10075 U.D.C.: NO: 20081171 A Dissertation for the Degree of Agriculture Effects of atrazine and photosynthetic bacteria

2、 on immunity of Neocaridina denticulate sinensis Candidate: Supervisor: Academic Degree Applied for : Specialty: University: Date of Oral Examination: Liu Tao Prof. Kang Xianjiang Master of Agriculture Aquaculture Hebei University May , 2012 摘 要 I 摘 要 本论文以中华锯齿米虾(Neocaridina denticulate sinensis)为实验材

3、料，通过不同莠去 津浓度(0.29 mg/L、1.46 mg/L、2.92 mg/L、5.84 mg/L、空白对照和溶剂对照)处理和养 殖水体添加类球红细菌 (Rhodobacter sphaeroides)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)及混 合菌并通过饥饿处理，研究对中华锯齿米虾血淋巴中小颗粒细胞的比例，以及肝胰腺、 肌肉、 卵巢中超氧化物歧化酶(SOD)、 碱性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)活性的影响。 通过莠去津对中华锯齿米虾的急性毒性实验，计算得到莠去津对中华锯齿米虾 96 hLC50 为 29.17 mg/L。 中华锯齿米虾中血淋巴中小颗粒细胞所占比例

4、为 38.41%，实验结果表明莠去津可 以显著降低中华锯齿米虾血细胞中的小颗粒细胞的比例(P颗粒细胞， 细胞形态和核质比大小 基本与其他甲壳动物血细胞相同。但三种血细胞作用不同，普遍认为小颗粒细胞在细胞 免疫中是宿主防御的关键细胞。小颗粒细胞对外源物质十分敏感，其受到非己物质刺激 时，通过胞吐作用释放酚氧化酶原系统组分，可以激活透明细胞的吞噬作用或颗粒细胞 的胞吐作用，后者将释放大量有活性的酚氧化酶组分。由于小颗粒细胞的重要作用，推 测中华锯齿米虾血细胞中小颗粒细胞所占比例的变化，可能会影响其免疫力的改变。 第3章 莠去津对中华锯齿米虾血细胞种类组成的影响 11 图 3.1 中华锯齿米虾血细胞

5、形态 透明细胞(HC)小颗粒细胞(SGC)颗粒细胞(GC) Fig3.1 The blood cell morphology of N. denticulata sinensis Hyaline cell(HC) Semi-granular cell(SGC) Granular cell(GC) 3.2.2 莠去津对小颗粒细胞所占比例的影响 实验结果见表 3.1 与图 3.2。 在相同暴露时间，不同莠去津浓度作用下，中华锯齿米虾血细胞中小颗粒细胞所占 比例下降幅度不同。在 10 d 时，0.29 mg/L、1.46 mg/L、2.92 mg/L 和 5.84 mg/L 组中华 锯齿米虾血细胞中

6、小颗粒细胞与空白对照组比较，分别下降了 8.07%、8.30%、19.01% 和 24.90%；在 20 d 时分别下降了 5.07%、10.09%、19.27%和 23.04%；在 20 d 时分别下 降了 5.07%、10.09%、19.27%和 23.04%；在 30 d 时分别下降了 10.58%、18.15%、24.1% 和 31.89%；在 40 d 时分别下降了 17.61%、20.63%、30.52%和 37.02%。与空白对照相 比均存在显著性差异(P0.05)； 30 d 与 40 d 时情况相同，随着莠去津浓度的升高肝胰腺 ALP 活性逐渐降低。 莠去津对中华锯齿米虾卵巢

7、 ALP 活性影响。各浓度组随着暴露时间的增加与同期 空白对照组都存在显著差异(P0.05)，只有在 40 d 时存在显著差异(P0.05)， 20 d 到 40 d 时肌肉 ALP 活性略低于空白对照组保 持一个相对稳定的状态；2.92 mg/L 与 1.46 mg/L 组没有显著性差异(P0.05)；5.84 mg/L 组 10 d、30 d 到 40 d 时与 1.46 mg/L 和 2.92 mg/L 组没有显著性差异(P0.05)，只有 20 d 时略低于 1.46 mg/L 和 2.92 mg/L 肌肉 ALP 活性。 第4章 莠去津对中华锯齿米虾组织、器官中免疫相关酶活性的影响

8、25 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 01020304050 时间(d) ALP活性(U/mL) 空白对照 溶剂对照 0.29 mg/L 1.46 mg/L 2.92 mg/L 5.84 mg/L 图 4.6 莠去津对中华锯齿米虾肌肉组织 ALP 活性的影响 Fig4.6 Effects of atrazine on the ALP activity in muscle tissues of N. denticulate sinensis 从实验结果可以看出，随着莠去津浓度的增加和暴露时间的延长，只有肝胰腺中 ALP 活性始终与空白对照组存在显著性差异(P0.05)

9、。 第4章 莠去津对中华锯齿米虾组织、器官中免疫相关酶活性的影响 27 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 01020304050 时间(d) ACP活性(U/mL) 空白对照 溶剂对照 0.29 mg/L 1.46 mg/L 2.92 mg/L 5.84 mg/L 图 4.8 莠去津对中华锯齿米虾卵巢 ACP 活性的影响 Fig4.8 Effects of atrazine on ovarian ACP activity of N. denticulate sinensis 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00 1.

10、05 1.10 01020304050 时间(d) ACP活性 空白对照 溶剂对照 0.29 mg/L 1.46 mg/L 2.92 mg/L 5.84 mg/L 图 4.9 莠去津对中华锯齿米虾肌肉组织 ACP 活性的影响 Fig4.9 Effects of atrazine on the ACP activity in muscle tissues of N. denticulate sinensis 通过实验结果可以看出在相同暴露时间时，各浓度莠去津对中华锯齿米虾肝胰腺 ACP 活性的影响存在显著差异(P0.05)，所以认为中华锯齿米虾肝胰腺相对于肌肉和卵 巢对莠去津更为敏感。 河北大学

11、农学硕士学位论文 28 中华锯齿米虾的酸性磷酸酶，来自于小颗粒细胞和颗粒细胞的颗粒体，是巨噬细胞 内溶酶体的标志酶，是溶酶体的重要组成部分，可以催化磷酸单酯的水解反应及磷酸基 团的转移反应，能加速物质的摄取和转运。碱性磷酸酶一种磷酸单脂酶，可催化所有的 磷酸单酯的水解反应及磷酸基团的转移反应，它直接参与磷代谢，并与 DNA、RNA、 蛋白质、脂质等代谢有关，加速物质的摄取和转运。ALP 对钙质的吸取、磷酸钙沉积、 骨骼形成、甲壳素分泌及形成都有着重要的作用虾蟹类等甲壳动物在生长过程中都要 经历蜕壳过程，该酶对虾蟹类的生存、生长有着特别重要的意义。ALP 活性升高，可加 速河蟹细胞中的物质代谢，

12、为 ADP 磷酸化形成 ATP 提供更多所需要的无机磷，从而促 进河蟹生长，进而间接地增强了其非特异性免疫能力。已有的研究结果证明, 在甲壳动 物血细胞进行吞噬和包围化的免疫反应中, 会伴随有 ACP 和 ALP 的释放。 实验结果表明，随着莠去津浓度的增大和暴露时间的延长，其对中华锯齿米虾肝胰 腺、卵巢和肌肉中 ALP 和 ACP 活性逐渐降低，其中肝胰腺 ALP 和 ACP 活性变化各组 间均存在显著差异(P0.05)。 第5章 光合细菌对中华锯齿米虾血细胞种类组成的影响 29 第5章 光合细菌对中华锯齿米虾血细胞种类组成的影响 甲壳动物的免疫系统中， 血细胞起到主要作用。 其血细胞一般分

13、为三类： 透明细胞、 小颗粒细胞和颗粒细胞，其中小颗粒细胞活跃的胞吐作用和脱颗粒作用与识别异物的能 力有关，因此认为它是防御反应的关键细胞。光合细菌可以分解养殖水体中有机废物净 化水质，其代谢过程会释放一些抗病因子，增强甲壳动物的免疫功能。光合细菌对中华 锯齿米虾免疫力的影响可以表现为，经过光合细菌处理后中华锯齿米虾血细胞中小颗粒 细胞所占比例的变化。 5.1 材料与方法 5.1.1 材料 中华锯齿米虾产自河北省保定市白洋淀自然水体，购于保定市东风桥市场。光合细 菌为类球红细菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)由河北大学微生物实验室提供。 5.1.2 仪器与试剂 5.1.2.

14、1 主要仪器 OLYMPUS 显微镜、血球计数板、玻璃缸、微量取液器、烧杯。 5.1.2.2 试剂 莠去津(97%原药，济南科赛基农化工有限公司)、二甲基亚砜(助溶剂，Amerco 公 司)、甲醛。 5.1.3 方法 中华锯齿米虾每 20 尾放入一个玻璃缸中，缸内为 10 L 曝气水，充气。共 12 个玻 璃缸分为 4 组，每组 3 个平行。一组水体为类球红细菌与枯草芽孢杆菌的混合水体，密 度分别为 4104个/mL 与 9104个/mL，二组水体内枯草芽孢杆菌的密度 1.8105个/mL， 三组水体内类球红细菌的密度为 8104个/mL，四组为空白对照。取两次材料，第 1 次 在暂养 3 个

15、月后，然后停止喂食。第 2 次在 4 个月后。取血时先用 1 mL 一次性注射器 吸取少量 10甲醛溶液，然后从心脏处取血，后在含总体积 0.1 mL10甲醛溶液的 Ep 管中混匀，吸取少量血细胞悬液置于血球计数板上，显微观察统计血细胞总数与小颗粒 细胞的数量，并计算小颗粒细胞所占比例。试验数据通过 SPSS13.0 和 Execl 软件处理。 河北大学农学硕士学位论文 30 5.2 结果 小颗粒细胞所占比例结果见表 5.1 与图 5.1。 在正常投饵饵料情况下，混合菌液、枯草芽孢杆菌、类球红细菌与空白对照组，中 华锯齿米虾血细胞中小颗粒细胞所占比例有显著差异(P0.05)。混合菌液组、枯草芽

16、孢 杆菌组和类球红细菌组中华锯齿米虾血细胞中小颗粒细胞所占比例高于空白对照组 8.10%、7.19%和 6.75%，饥饿处理后，混合菌液组、枯草芽孢杆菌组和类球红细菌组小 颗粒细胞所占比例比空白对照组相比高出 26.31%、24.56%和 33.74%。 表 5.1 不同水质条件对小颗粒细胞细胞所占比例的影响 Table5.1 Different water quality conditions on the proportion of Semi-granular cell 组别 喂食情况 小颗粒细胞所占比例 投饵 41.62%2.12% 混合菌液 未投饵 39.97%2.28% 投饵 41.28%2.55% 枯草芽孢杆 菌 未投饵 36.25%2.45% 投饵 41.10%1.93% 类球红细菌 未投饵 42.32%2.08% 投饵 38.50%2.33%