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1、第二军医大学 硕士学位论文 肾透明细胞癌TCF19基因选择性剪接异构体的类型和表达特点 姓名：钱涛 申请学位级别：硕士 专业：泌尿外科 指导教师：侯建国 20100501 肾透明细胞癌T C F l 9 基因选择性剪接异构体的类型和表达特点 摘要 【目的】探索人肾透明细胞癌( c l e a rc e l lr e n a lc e l lc a r c i n o m a ，c c R C C ) 是否存 在与细胞生长调节相关的转录因子1 9 ( T C F l 9 ) 选择性剪接异构体，探索其表达特点及 其与c c R C C 发生的关系。 【方法】采用c D N A 基因表达谱芯片研究实
2、验室建立的汉族人能够无限传代的2 株在动 物模型中已证实具有转移潜能的R C C 细胞系( R C C 0 5 - T X 3 、R C C 0 5 - Z Y J ) 基因表达谱，从 中选取T C F l 9 为兴趣基因。通过选择性剪接数据库( A l t e r n a t i v eS p li c i n gD a t a b a s e ， A S D ) 对基因T C F l 9 可能存在的选择性剪接异构体进行预测分析。针对预测结果，使用 P r i m e rP r e m i e r5 0 及O l i g o6 0 软件设计5 种预测异构体的R T - P C R 引物，进行
3、P C R 反应， 将P C R 产物凝胶回收，与p M D l 8 T 载体连接，经0 【筛选后转染D H 5 a 感受态细胞，菌 液送测序，应用计算机软件进行序列的比对分析。经验证从组织中扩增的产物与生物信 息学预测结果一致，确认为新的选择性剪接异构体后，设计R e a l t i m e 引物，在3 2 例原 发癌组织及癌旁组织样本中定量检测T C F l 9 1 、T C F l 9 3 选择性剪接异构体的表达水平 及差异。c c R C C 原发肿瘤标本来源于2 0 0 5 年1 月一2 0 0 8 年1 2 月长海医院泌尿外科肾癌 根治术的患者，其中包括3 2 例c c R C C
4、 原位组织及其相应癌旁组织。男性2 2 例，女性l O 例，平均年龄为5 2 8 6 岁，最小年龄为3 6 岁，最大为7 8 岁，经病理证实，均为肾透明 细胞癌。 【结果】c c R C C 组织中存在两种新型T C F l 9 替换剪接异构体( T C F l 9 - 1 、T C F l 9 - 3 ) 。 R e a l - t i m eR T - P C R 检测结果发现这两种异构体在癌和癌旁组织中均表达，但T C F l 9 - 1 在 原发癌组织中表达率远高于癌旁组织( P l ，该完整性可以满足绝大部分后续实验要 求了。使用A 2 6 0 A 2 9 0 判断R N A 的纯度
5、，且如果R N A 是纯的，其A E 6 0 E S 0 = 2 0 左 右。试验中许多抽提R N A 时使用的试剂，以及样品中的许多杂质都在A 2 6 0 和A 2 8 0 处附近有吸收，对A 2 6 0 A 2 8 0 产生影响，因为该比值对所有影响酶反应的杂质的残留 肾透明细胞癌T C F l 9 基因选择性剪接异构体的类型和表达特点 都敏感。 4 、R N A 的混合 本研究中将原发肾细胞癌组织及癌旁组织分别混合后抽提总R N A 作为R T - P C R 的模板，采用混合的组织样本，可增大对异构体检测的灵敏度，可能发现新的异构体， 以免由于样本间差异导致异构体检测的假阴性。 ( -
6、 - ) 异构体的预测及引物设计 1 、剪接异构体研究方法的选定 m R N A 的选择性剪接调控着机体不同发育阶段、不同环境的生理需要，正常的 m R N A 选择性剪接模式的改变则会导致某些遗传疾病与肿瘤的发生和发展。目前一 些研究发现选择性剪接在肿瘤细胞中发生频率较高n4 1 5 1 。而选择性剪接形式多样，包 括：通过外显子上不同的5 或3 剪接位点进行选择性剪接；对5 端和3 端的选择性 剪接；内部外显子可以被选择保留或切除；多个外显子可以进行不同组合的可变拼接； 内含子可以被选择保留在m R N A 中等n 6 J 钉。且有些变异转录本的丰度异常低，这就 给在组织特定阶段、生理或病
7、理条件下，确定特异的变异转录本的种类、变异转录本 的外显子组成带来了一定的困难。近年来，人们越来越认识到选择性剪接研究的重要 性，开发出一系列研究方法。 ( 1 ) 芯片技术 D N A 芯片由固定寡核苷酸、c D N A 和基因片段等形成微阵列构成，又称基因芯 片。为了解哪个组织会有外显子表达量特别高的情况，外显子芯片应运而生。芯片上 每一个探针的设计主要是参照了基因外显子簇、相关联的外显子以及转录簇 ( t r a n s c r i p tc l u s t e r ) 的序列。把每个外显子( c D N A 和E S T ) 当作一个探针选择区( p r o b e s e l e c
8、 t i o nr e g i o n ，P S R ) ，每个选择区设计4 个以上探针，在已知的外显子基础上增加 一些预测的外显子序列，可以确保筛选的精确性。H u 等n 明发明了一种预测选择性剪 接的方法：首先，根据探针浓度的相似性和物理距离分为若干个假定外显子的探针簇， 一个假定外显子被定义为一个多探针具有相似密度值的一段序列；然后分析2 组样品 探针密度的统计学差异，差异性表达的假定外显子被预测为选择性剪接。该方法分为 2 步：一是运用多探针密度预测假定外显子；二是鉴定在2 种样本中差异表达的假定 外显子。H u 等将探针合并成代表一个假定外显子的簇，用统计学方法检验假定外显 子在2
9、组样本中是否存在差异性表达，存在差异者被认为是存在选择性剪接的假定外 显子。但由于芯片技术限制了可预测异构体的范围，且价格较贵，并不利于广泛普及。 ( 2 ) c D N A 库的筛选 由m R N A 逆转录产生的c D N A 中含有基因组的大部分信息，但仅占总D N A 量 2 9 第二军医大学硕士学位论文 的3 ，因此研究c D N A 并建立e D N A 文库可以在短时间内获得D N A 的大量信息， 与研究整个基因组D N A 相比，更加简便和快速。核酸杂交法是从c D N A 文库中筛选 目的基因最常用、最可靠的方法，主要有菌落杂交与嗜菌斑杂交法。以嗜菌斑杂交法 为例，将噬菌体
10、感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性，然后通过目的探针进行 杂交、放射性自显影，杂交信号对应的噬菌斑即为阳性克隆。通过将膜与原始平板进 行比较，标出被杂交区域，可以鉴别出最初的菌落或嗜菌斑。这些菌落和嗜菌斑再以 较低的密度重新涂板，重复杂交直至获得单克隆。但c D N A 文库筛选的也存在一些问 题，主要表现在灵敏度不够，过程较为繁琐，需多次稀释涂板以获得单克隆，且耗时 较长。 ( 3 ) c D N A 末端快速扩增技术 c D N A 末端快速扩增( r a p i da m p l i f i c a t i o no f c D N Ae n d s ，R A C E ) 是扩增在m
11、 R N A 的3 端或5 端的未知序列和已知部分外显子序列问的核酸序列的方法。R A C E 实质上 是长距离的P C R ，即利用全长c D N A 中间部分己知序列( 如E S T ) ，通过E S T 技术扩 增出靶e D N A3 端和5 端。3 R A C E 的基本原理是：首先通过已知序列设计基因特异 引物G S P ；然后用由o l i g o ( d T ) 和酶切位点组成的锚定引物逆转录包含有p l o y ( A ) 尾的 m R N A ，获得单链c D N A 文库。通过锚定引物配对序列和G S P 就能钓出靶c D N A3 端并进行扩增，然后应用巢式P C R 进
12、行第2 轮扩增以排除非特异性扩增产物。同样 原理可进行5 端R A C E 。可先采用基因特异性引物G S P R T 逆转录m R N A 获得单链 c D N A 库，然后利用术端脱氧核苷酰转移酶T d T 和d A T P 在c D N A5 端加上p l o y ( A ) 尾。其后等同于3 R A C E ，利用锚定引物配对序列和G S P R T 上游的G S P 扩增出c D N A 5 端，并进行第2 轮P C R 提高特异性。R A C E 技术是从选择性剪接的已知序列( 如 E S T ) 获得完整的选择性剪接转录本最简便、最有效的方法。通过电子克隆等技术， 尽可能延长已知
13、序列，减少3 和5 端未知序列的长度，同时与提高反应灵敏度和特 异度的技术相结合，可以尽可能高地发挥R A C E 技术的效力。 ( 4 ) 生物信息学研究 高通量的人类基因组序列，特别是E S T 的测序，产生了完全不同的以生物信息 学为基础的选择性剪接研究方法。因为E S T 是从整个m R N A 群体来的序列标签，它 们提供大量不同m R N A 的信息，这种多样性可以用计算机技术来分析。在过去的两 年里，用生物信息学的手段发现了大量的选择性剪接基因，比过去2 0 年中发现的要 多得多。目前公共数据库里有代表不同组织的，约1 ，5 0 0 ，0 0 0 条以上选择性剪接的 E S T
14、s ，其中还包括人发育的不同阶段的E S T s ( 从胚胎到老年) 。分子生物学研究发现 仅局限于一个或者少数几个调控事件。生物信息学则将大量更新中的选择性剪接数据 和多种生物的全基因组序列结合起来，对揭示选择性剪接调控机制起到非常重要的作 3 0 肾透明细胞癌T C F l 9 基因选择性剪接异构体的类型和表达特点 用。 利用生物信息学研究选择性剪接有以下目的：1 ) 发展一些有效的计算方法，用 这些方法和大量的E S T s 数据预测人类的选择性剪接基因；2 ) 建立一个实验验证过 的选择性剪接数据库，或创建一个预测性的选择性剪接基因数据库，它可以当作最初 的资源去检测特定基因的选择性剪
15、接情况，也可以用做疾病基因的诊断标记，对研究 选择性剪接事件的起源也十分重要。3 ) 用实验验证生物信息学方法预测的选择性接 剪接基因，确定剪接位点预测的正确性，进而可以验证预测方法是否J 下确，以获得可 靠的预测方法呦1 。随着人类基因组测序的完成，将E S T s 与基因组序列进行比对成为 基因选择性剪接预测中快速、实用而有效的方法。生物信息学一个很大的贡献就是建 立数据库，为设计实验提供依据并能使研究者从众多的数据中总结出生物学规律，同 时数据库的建立又是以实验结果为依据的。 本研究采用A S D 针对T C F19 进行生物信息学分析，该数据库系统地收集了关于 选择性剪接外显子、内含子
16、和剪接异构体方面的数据并给予注释，且许多资源是从文 献中收集获得，数据经实验室证明，具有较高的可信度。 2 、异构体引物的设计 为提高引物的效率，我们尽量使一对引物只能区分开一种异构体，避免一对引物 扩增得到两种甚至多种P C R 产物。如果实在无法避免，则要求从片段大小区分开来。 首先我们排除预测异构体T C F l 9 2 ，因为其可能是E S T 、m R N A 及基因匹配过程中产 生的转录产物的一部分，亦可能是T C F l 9 - 1 异构体的一部分。 在所设计的引物中第1 、3 、6 对异构体采用了相同的引物，理论上假如预测的5 种异构体均存在，则该引物对可扩增到3 种长度的异构体，但从片段大小可将它们区 分开来；其余的引物对分别只能扩增出特异的异构体片段，可看出这5 对引物不仅能 特异的扩增到相应异构体，而且还能起到互证的作用。 ( 三) 对测序结果的分析 通过优化P C R 条件，我们在混合转移组织( M ) 、原发肾细胞癌组织( R ) 及癌 旁组织( L ) 中验证预测的异构体，如图1 2 所示，
