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1、生物化学实验手册学时：36 学分：1.5课程属性：专业必修课 开课单位：华侨大学生物医学学院 先修课程：高等数学、普通物理学、无机及分析化学、有机化学一、课程的性质与任务 生物化学实验课是在学习生物化学理论课的基础上进行的一个实践性环节，本课程的教学任务是让学生运用已学过的知识验证一些结论、结果和现象，及综合运用已学过的理论知识设计实验或进行综合性的实验，巩固和加深对生物化学课程中基本理论知识的理解，训练学生理论知识的运用能力、实验操作技能、实验数据的处理和分析能力。二、实验目的与基本要求本实验课配合理论教学，通过实验从实践中进一步学习，掌握和运用学过的基本理论；运用生物化学理论分析实验过程中
2、的各种现象和问题，培养、训练学生的分析和解决问题的能力。学生必须完成的基本要求：预习实验，准备实验；写出预习报告，拟定记录表格；测取实验数据；整理实验数据；写出实验报告。三、实验项目一览表生物化学实验项目一览表序号实验项目名称实验类型实验要求适用专业学时12345678910111213氨基酸的分离鉴定纸层析法紫外分光光度法测定蛋白质的含量Bradford法测定蛋白质的含量Folin-酚法测定蛋白质的含量垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质脲酶的动力学研究用正交法测定几种因素对酶活性的影响DNA的提取与测定琼脂糖凝胶电泳实验还原糖和总糖的测定可溶性糖的硅胶G薄层层析维生素C含量的定量测定卵磷脂的
3、提取、纯化和鉴定基础性基础性基础性基础性综合性基础性基础性综合性综合性基础性基础性基础性设计性必做必做必做必做必做必做必做必做必做必做必做必做必做生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类生物医学类3222622333323四、实验考核方式及办法考核方式：考查和实验成绩。 实验考查成绩占总成绩的30%。 实验成绩占总成绩的70%。实验成绩评分办法：实验操作占40%，实验态度占20%，实验报告占40%。五、实验项目的具体内容。实验一：氨基酸的分离鉴定纸层析法一、实验目的通过对氨基酸的分离，学习运用纸层析法分离氨基酸混合
4、物的基本原理，掌握纸层析的操作方法。二、实验原理纸层析（Paper Chromatography，简称PC），是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上有亲水性的羟基，通过吸附一层水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。物质被分离后在纸层析图谱上的位置用Rf值（比移值）来表示：Rf值 = 原点到层析点中心的距离/ 原点到溶剂前沿的距离在一定条件下某种物质的Rf值是常数，其大小受物质的结构、性质、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等多种因素影响
5、。此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多均会影响的有效分离。无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸纸层析图谱常用茚三酮或吲哚醌作为显色剂，本实验采用茚三酮作为显色剂。三、仪器与试剂 （一）实验器材（1）层析缸 （2）微量器枪头（3）喷雾器（4）培养皿（5）电吹风机 （6）层析滤纸 （7）直尺（二）实验试剂（1）扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份冰乙酸的混合物。将20毫升正丁醇与5毫升冰乙酸放入分液漏斗中与15毫升水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，取漏斗内的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。（2）氨基酸溶液：2mg/mL的赖氨酸、甘
6、氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸溶液以及它们的混合液。（3）显色剂：0.5%水合茚三酮正丁醇溶液。四、操作步聚1. 将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中，取长22厘米，宽14厘米的层析滤纸一张，在滤纸的一端距边缘2-3厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2厘米作一记号，等待点样。2. 点样：用毛细管将各氨基酸样液分别点在7个位置上，注意一定要每个点用一个毛细管，避免混用污染。样点干燥后再点2-3次，每点在滤纸上的扩散直径范围在3毫米内为最佳。3. 扩展：用针线将滤纸缝成圆筒状，注意纸的两边不能接触，留一定缝隙。将盛有约20毫升扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸垂直立于培
7、养皿中，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1厘米，待溶剂上升至距离滤纸上端2厘米左右时取出滤纸，用铅笔在溶剂前沿划一边界线，自然干燥或用电吹风机吹干溶剂。4. 显色：用喷雾器均匀喷上0.5%茚三酮正丁醇溶液，然后置100烘箱烘烤5分钟或用电热风吹干即可显出各层析斑点。5. 计算各种氨基酸的Rf值。五、思考题为什么不同的氨基酸有不同的Rf值，影响本实验Rf值精确性的因素有哪些？实验二： 紫外分光光度法测定蛋白质的含量一、实验目的了解紫外吸收法测定蛋白质的含量的原理，掌握紫外分光光度的使用方法以及紫外分光光度法测定蛋白质含量的方法。二、实验原理蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，使
8、蛋白质对280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。该法操作简单、快捷，并且测定的样品可以回收，低浓度盐类不干扰测定，故在蛋白质和酶的生化制备中广泛被采用。但此方法存在以下缺点：1当待测的蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差别较大是会产生一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的样品。2若样品中含有其他在280nm吸收的物质如核酸等化合物，就会出现较大的干扰。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm两处的光吸收值，通过计算可以适当的消除核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同
9、的，虽经校正，测定结果还存在着一定的误差。三、实验器材1紫外分光光度计 2移液管 3试管及试管架 4石英比色皿四、材料与试剂1标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮校正的牛血清清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。2待测蛋白溶液：酪蛋白稀释溶液，使其浓度在标准曲线范围内。五、操作方法1标准曲线的制作表1 标准曲线的制作管号12345678标准蛋白质溶液/mL00.51.01.52.02.53.04.0蒸馏水/mL43.53.02.52.01.51.00蛋白质浓度/（mg/mL）00.1250.250.3750.500.6250.751.00A280A260按表1加入试剂。混匀后, 选用1cm的石
10、英比色皿，在波长280nm处测定各管的吸光值。以蛋白质的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出血清蛋白的标准曲线。2未知样品的测定取待测蛋白质溶液1mL，加入3mL蒸馏水，在280nm下测定其吸光度值。并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。实验三： Bradford法测定蛋白质的含量一、实验目的学习考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质浓度的原理和方法。二、实验原理1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的原理，迅速而准确的定量蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的
11、灵敏度（最低检出量为1g）。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子（如K+，Na+，Mg2+），（NH4）2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX-100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛用于蛋白质含量的测定。三、实验器材1天平 2分光光度计 3试管及试管架 4比色皿 5移液管四、材料与试剂1考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%（W/V）磷酸，将溶液用水稀释到1000mL。试剂
12、的终含量为：0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸。2标准蛋白质溶液：可用牛血清白蛋白预先经凯氏定氮法测定蛋白含氮量，根据其纯度配制成1mg/mL的溶液。3未知样品液。五、操作方法1. 牛血清蛋白标准曲线的制作表2 牛血清蛋白标准曲线的制作试管号123456标准蛋白液/mL00.20.40.60.81.0水/mL10.80.60.40.20每管中所含标准蛋白质的量/mg02004006008001000G-250染色液/mL555555室温下静置2minA595取6支试管，编号为1、2、3、4、5、6，按表2加入试剂。混匀后静置2min，以1号管作空白
13、对照,测定各管595nm下的吸光值，以吸光植为纵坐标，蛋白浓度为横坐标作图，得到标准曲线。2未知样品中蛋白质的测定取未知浓度的蛋白液（通过适当稀释，使其浓度控制在0.015-0.1mg/mL范围内）加到1mL试管内，再加入G-250染色液5mL混匀，测其595nm下的吸光度，对照标准曲线求出未知蛋白液的浓度。六、思考题1比较两种方法的测定结果, 分析紫外法和Bradford法测定蛋白质含量的各自有哪些优点和缺点？2若样品中含有核酸杂质，紫外法测定时应如何排除干扰？实验四：Folin-酚法测定蛋白质的含量一、实验目的学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。进一步掌握比色法或分光光度法在实
14、际测量中的应用和注意事项。二、实验原理 Folin-酚试剂法是测定蛋白质含量的经典方法，它是在双缩脲法的基础上发展而来的。它操作简单、迅速、灵敏度高，叫双缩脲法灵敏100倍。Folin-酚法所用的试剂由两部分组成，试剂A相当于双缩脲试剂。蛋白质中的肽键与试剂A中的碱性硫酸铜反应形成铜-蛋白质复合物。这个复合物可与试剂B中磷钼酸-磷钨酸发生氧化还原反应。由于磷钼酸与磷钨酸易被酚类化合物还原而呈蓝色反应。而蛋白质中的酪氨酸和色氨酸均可发生此呈色反应。颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色法测定蛋白质的含量。此法易受蛋白质样品中酚类化合物及柠檬酸的干扰。另外，试剂B中的磷钼酸-磷钨酸仅在酸性pH值时稳定，故在将试剂B加入到碱性的铜-蛋白质溶液时，必须立即混合均匀。以确保还原反应能正常发生。此法也适用与酪氨酸和色氨酸的定量测定。三、实验器材 试管及试管架。 分光光度计。 吸管：0.5ml、1ml、5ml。四、材料与试剂 F
