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1、附件5C-肽测定试剂注册技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对C-肽测定试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。本指导原则是对C-肽测定试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平
2、下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。一、适用范围C-肽测定试剂是指利用抗原抗体反应的免疫学方法对人血清、血浆或其他体液中的C-肽（C-Peptide）进行体外定量检测的试剂。本指导原则适用于以酶标记、（电）化学发光标记、（时间分辨）荧光标记等标记方法标记抗体，以微孔板、管、磁颗粒、微珠和塑料珠等为载体包被抗体，定量检测C-肽的免疫分析试剂，不适用于以胶体金或其他方法标记的定性或半定量测定的C-肽试剂、用放射性同位素标记的各类放射免疫或免疫放射测定试剂。根据体外诊断试剂注册管理办法（国家食品药品监督管理总局令第5号）和食品药品监管总局关
3、于印发体外诊断试剂分类子目录的通知（食药监械管2013242号），C-肽测定试剂的管理类别为二类，分类代码为6840。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。二、注册申报资料要求（一）综述资料C-肽（C-Peptide）又称连接肽，是胰岛细胞的分泌产物，它与胰岛素有一个共同的前体胰岛素原。一个分子的胰岛素原经酶切后，裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的C-肽。正常情况下，人胰岛细胞主要分泌产生并释放到血液中的是胰岛素，在产生胰岛素的一系列的过程中，胰岛细胞首先合成胰岛素原。胰岛素原是一条很长的蛋白质链，胰岛素原在酶的作用下被分解为三段，前后两段又重新联接，成为有A链和B链组成的
4、胰岛素，中间一段独立出来，称为C-肽。C-肽是由31个氨基酸组成的连接肽，分子量约3021道尔顿。C-肽本身无生物活性，由于胰岛素和C-肽是以等摩尔浓度分泌的，进入血液后，大部分胰岛素经肝脏被灭活，而C-肽被肝脏摄取很少，加上C-肽降解速度比胰岛素慢，所以血液中C-肽浓度比胰岛素高，一般在5倍以上，故C-肽更能准确反映胰岛细胞的功能。因此测定血液中C-肽水平可作为胰岛细胞分泌功能的重要指标，特别对用外源性胰岛素治疗的糖尿病人更需要测定其C-肽，因胰岛素制剂中不含C-肽，不影响患者血液中C-肽的水平。C-肽水平测定可应用于糖尿病分型及了解糖尿病患者胰岛细胞的功能。无论1型或2型糖尿病患者，初病时
5、都应通过检测C-肽或胰岛素水平以判断胰岛细胞功能。由于外周血中C-肽被肝细胞摄取少，更能反映胰岛细胞分泌时浓度，加之其基础清除率稳定，不受多种因素影响，故C-肽释放试验曲线下面积优于胰岛素释放试验，更能代表胰岛细胞功能。另外，对于应用外源性胰岛素的测定，由于C-肽与胰岛素抗体无交叉反应，不受胰岛素抗体干扰，外源性胰岛素又不含C-肽，故C-肽测定显得更为重要，对了解胰岛细胞功能情况、指导治疗有积极作用。综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性方面的说明、研究结果的总结评价以及同类产品在国内外上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学、临床应用情况、申报注册产品与
6、目前市场上已获批准的同类产品之间的异同方面进行介绍。应符合体外诊断试剂注册管理办法（国家食品药品监督管理总局令第5号）和关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。（二）主要原材料研究资料（如需提供）1.测定试剂所用抗体的制备、筛选、纯化以及鉴定等详细试验资料。如抗体为申请人自制，则应详述抗体的名称及生物学来源，申请人对该抗体技术指标的要求（如外观、纯度、蛋白浓度、效价等），且其生产工艺必须相对稳定，并对其工艺有相关的验证。同时确定该抗体作为主要原材料的依据和质量标准；如为申请人外购，则应详述其名称及生物学来源，外购
7、方名称，提交外购方出具的抗体性能指标及检验证书，详述申请人对该抗体技术指标的要求以及申请人确定该抗体作为主要原材料的依据。2.校准品、质控品（如有）的原料选择、制备、定值过程及试验资料。3.申请人应根据GB/T 214152008/ISO 17511：2003体外诊断医疗器械生物样品中量的测量 校准品和控制物质赋值的计量学溯源性提供所用校准品的来源、赋值过程和相应指标、以及不确定度等内容。明确校准品的质量标准并提供校准品的溯源性文件，校准品应溯源至现行的国家标准品或国际标准品。（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料（如需提供）生产工艺主要包括：各组分制备工艺的研究，包括试剂的配方及工艺关键参数
8、的确定依据等。反应体系主要包括：反应条件、样本用量、试剂用量等确定的依据。1.主要生产工艺介绍，可以流程图方式表示，并简要说明主要生产工艺的确定依据。2.产品反应原理介绍。3.抗体包被工艺研究：申请人应考虑如包被缓冲液及添加量、浓度、时间、温度等指标对产品性能的影响，通过试验确定上述指标的最佳组合。4.体系反应条件确定：申请人应考虑反应模式、反应时间、反应温度、洗涤次数等条件对产品性能的影响，通过试验确定上述条件的最佳组合。5.体系中样本及试剂的加样方式及添加量确定：申请人应考虑样本加样方式、加样量以及试剂添加顺序、添加量对产品检测结果的影响，通过实验确定最佳的样本及试剂的添加方式和添加量。如
9、样本需采取稀释或其他必要的方法进行处理后方可用于最终检测，申请人还应对可用于样本稀释的基质或处理方法进行研究，通过试验确定样本稀释基质或处理方法。确定反应所需其他试剂用量（校准品、标记物、底物等）的研究资料。固相载体、信号放大系统、酶作用底物等的介绍及研究资料。6.样本类型的研究（如适用）如果试剂盒适用样本类型包括血浆样本，应采用各种抗凝剂抗凝的血浆样本分别与血清样本进行对比实验研究。方法为对比线性范围内的同一病人的血清和血浆样本，应包含医学决定水平以及低值浓度样本进行检测以验证申报试剂对于血清和血浆样本检测结果的一致性。如同一病人的不同抗凝剂抗凝的低值血浆样本难以获得，可采用高值血清样本分别
10、添加到健康人的不同抗凝剂抗凝的血浆样本中进行验证。（四）分析性能评估资料企业应提交产品研制阶段进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、质控标准、实验数据、统计分析等详细资料。建议选择不少于3批产品对以下分析性能进行研究，包括空白限、线性、准确度、精密度、特异性等指标，具体研究方法建议参考相关的美国临床实验室标准化协会批准指南（CLSIEP）或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。对于适用多个机型的产品，应提供产品说明书【适用仪器】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料（主要性能）。如产品涉及不同包装规格，则需要提供每个包装规格在不同型号仪器上的评估资料；如不同包装规格之间不存在性能上的
11、差异，需要提交包装规格间不存在性能差异的说明。1.准确度对准确度的评价通常采用与参考物质（国家标准品或国际标准品）的偏差分析。将参考物质配制成指定浓度的准确度样品进行检测，计算相对偏差。2.空白限空白限的确定常使用同批号试剂对零浓度校准品（或校准品稀释液）进行至少20次重复检测，计算所得信号值均值和标准差（SD），将（+2SD）带入剂量反应曲线，计算出的浓度值即为空白限。3.线性建立试剂线性范围所用的样本基质应尽可能与临床实际检测的样本相似，理想的样本为分析物浓度接近预期测定上限的混合人血清，且应充分考虑多倍稀释对样本基质的影响。建立一种定量测定方法的线性范围时，需在预期测定范围内选择711个
12、浓度水平。例如，将预期测定范围加宽至130%，在此范围内选择更多的浓度水平，然后依据实验结果逐渐减少数据点直至表现出线性关系，确定线性范围。剂量反应曲线的线性可使用试剂盒校准品进行验证，用双对数或其他适当的数学模型拟合，计算剂量反应曲线的线性相关系数r。对于未配备校准品的试剂盒，取C-肽国家（或国际）标准品（或其他高浓度样本），按照试剂盒说明书声称的线性范围，配制适当的（一般应不少于5个）浓度点，建立相应的剂量反应曲线，计算线性相关系数r。也可以采用高浓度样本稀释的方法验证线性，将接近线性区间上限的高值样本按一定比例稀释为至少5个浓度，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。将测定浓度的平均值
13、与理论浓度或稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r。4.精密度 精密度的评估应使用3个浓度水平的质控品或样本进行测定，浓度包括参考区间附近的浓度值、中浓度值、高浓度值。一般包括批内、批间精密度的评价。（1）批内精密度：同一批次的测定试剂对线性范围内的3个浓度的质控品或样本进行重复检测10次，计算10次测量结果的平均值（）和标准差（SD），根据公式CV=SD/100%得出变异系数。（2）批间精密度：用不少于3个批次的测定试剂对线性范围内的3个浓度的质控品或样本各重复检测10次，计算3批测量结果的平均值（）和标准差（SD），根据公式CV=SD/100%得出变异系数。5.特异性（1）
14、交叉反应：易产生交叉反应的其他蛋白质激素等的验证情况，应至少验证与人胰岛素原和人胰岛素样本的交叉反应情况。如无法获得单纯高浓度的人胰岛素原或人胰岛素样本，可采用纯品物质分别添加到健康人样本、参考区间附近样本、中浓度值样本中的方式进行验证。（2）干扰物质：样本中常见干扰物质对检测结果的影响，如高脂、黄疸、类风湿因子、嗜异性抗体等干扰因子对检测结果的影响。如无法获得含有高浓度干扰物质的样本，可采用纯品物质分别添加到健康人样本、参考区间附近样本、中浓度值样本中的方式进行验证。建议将研究结果在说明书中进行说明。6.钩状（Hook）效应（如有）：说明不会产生Hook效应的浓度上限或相关研究，如需稀释，应
15、注明对稀释液的要求、最佳或最大稀释比例。每个浓度重复3份，对钩状效应进行合理的验证。建议在产品说明书上明示对钩状效应的研究结果。7.方法学比对（如有）采用参考方法或国内外普遍认为质量较好的已上市同类试剂作为参比方法，与拟申报试剂同时检测一批病人样品，从测定结果间的差异了解拟申报试剂与参比方法间的偏倚。如偏倚很小或在允许的误差范围内，说明两检测系统对病人标本测定结果基本相符，对同一份临床样本的医学解释，拟申报试剂与参比方法相比不会产生差异结果。在实施方法学比对前，应分别对拟申报试剂和对比试剂进行初步评估，只有在确认两者都分别符合各自相关的质量标准后方可进行比对试验。方法学比对时应注意质量控制、样
16、本类型、浓度分布范围并对结果进行合理的统计学分析。性能指标的评价方法并无统一的标准可依，可根据不同的试剂特征进行，前提是必须保证研究的科学合理性。具体实验方法可以参考相关的CLSIEP文件或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。（五）参考区间确定资料参考区间确定所采用的样本来源、确定方法及详细的试验资料。样本来源覆盖年龄、性别等因素，尽可能考虑样本来源的多样性、代表性。建议参考CLSI/NCCLS EP28A3C进行相应研究。（六）稳定性研究资料稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。试剂稳定性主要包括实时稳定性（有效期）、运输稳定性、开瓶稳定性等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详
