《胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞移植治疗大鼠脊髓近半切损伤的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞移植治疗大鼠脊髓近半切损伤的实验研究（107页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、山东大学 博士学位论文 胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞移植治疗大鼠脊髓近半切损伤的 实验研究 姓名：宋涛 申请学位级别：博士 专业：神经外科 指导教师：朱树干 20040401 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：日期：竺笙竺! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送
2、交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：耋亟导师签名：牡珥日期：盟组 山东大学博士学位论文 论文1 胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞的体外分离培养与分化研究 中文摘要 目的：用悬浮克隆培养技术，在体外从胚胎大鼠的脊髓组织分离神经干细胞， 并进行扩增传代培养，观察其自我复制和多潜能分化特性。 方法： 1 取材在解剖显微镜下取出胚胎第1 3 天( E 1 3 ) 大鼠的脊髓组织。 2 消化将取得的脊髓组织用消化液
3、( 1 3 4 m g m l 透明质酸酶溶液和0 2 5 的胰 蛋白酶溶液1 ：1 混合+ 0 2 m g m l 的犬尿烯酸1 消化。 3 分散和接种用吸管将组织块吹打分散，记数活细胞数后分别以4 1 0 4 m l 、 4 1 0 5 m l 和4 X1 0 6 m l _ 三种密度接种于2 4 孑L 培养板中，培养孔底部未涂任何底物， 细胞在3 7 “ C 、饱和湿度、5 C 0 2 条件开放悬浮培养于神经干细胞完全培养液中， 用神经干细胞完全培养液进行常规培养。 4 机械传代培养将原代培养6 7 天后形成的含初级神经干细胞球的培养液移 入小培养皿中，用细头经火抛光的玻璃吸管轻轻吹打，
4、用机械方法将大细胞球分 散成单细胞或分散成较小的细胞球。初级神经于细胞球经传代后形成的次级和再 次级神经干细胞球也依此方法传代。 5 神经干细胞的分化培养 5 1 在神经于细胞完全培养液中的分化将涂有多聚赖氨酸的玻璃盖片放入培 养孔，选择只贴有单细胞球的盖玻片放入新的培养孔中，在神经干细胞完全培养 液中观察其贴壁后的迁移、增殖和分化。 5 2 血清对贴壁分化的影响将贴有单细胞克隆的盖玻片放入新培养孔，从神经 干细胞完全培养液中撤除E G F 和b F G F 并添加1 0 的血清，观察其贴壁后的迁移、 增殖和分化。 6 免疫细胞化学方法对神经干细胞及其多分化潜能的鉴定分别用抗神经干 细胞特征性
5、骨架蛋I ! t N e s t i n 的抗体和神经元( M A P 2 ) 、少突胶质细胞( G c ) 和星 2 I “东大学博士学位论文 形细胞( G F A P ) 的特异性抗体，按S A B C 法分别鉴定初级和传代神经细胞球内部 是否有神经干细胞及其多潜能分化能力。 结果与结论 1 形成初级神经干细胞球的能力 胚胎大鼠脊髓组织内有能够自我复制和多分化潜能的神经干细胞，由它形 成的神经千细胞球能够耐受多次体外传代。 2 不同细胞接种密度对初级神经千细胞分裂增殖作用 在4 X1 0 a m l 这个接种密度下，细胞的重聚程度不会影响神经干细胞的增殖和 实验结果的记录，神经干细胞能够迅
6、速分裂增殖形成具有自我复制能力和多潜能 分化细胞球，并能够耐受体外传代。是比较理想的接种密度。 3 机械传代方法对次级神经干细胞分裂增殖能力的影响 机械吹打可以获得有活力的次级神经干细胞球，并能继续耐受传代。可以做 为常规的体外传代方法。 4 免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞及其多分化潜能 4 1 神经千细胞的染色鉴定初级和传代的神经干细胞球内的许多细胞表达 了哺乳动物神经干细胞的细胞骨架蛋白：巢蛋( n e s t i n ) 。证实我们已经成功地从 胚胎大鼠的脊髓组织分离出了神经干细胞。它们能够在体外以传代的方式扩增和 自我复制。 4 2 初级和次级神经干细胞球的多分化潜能 4 2 1 完全
7、培养液中神经干细胞球多分化潜能神经干细胞完全培养液中初级 和次级神经干细胞球贴壁后可以继续增殖。并能分化为神经系统的三种主要细胞 类型：神经元、星形细胞和少突胶质细胞。显示初级和传代的神经干细胞不但能 够自我复制而且都有多分化的潜能，其自我复制能力和多分化潜能在目前的实验 条件下能够维持。 4 2 2 血清对神经干细胞分化潜能的影响培养体系中的血清可以促进初级 和传代的神经干细胞向星形细胞的谱系方向分化，抑制神经元和少突胶质细胞形 成。体外培养的神经干细胞和由它们分裂增殖形成的细胞对培养体系中的营养因 子有一定的依赖性。如果得不到营养因子的支持则逐渐衰亡。 主题词神经干细胞脊髓悬浮培养自我复制
8、多潜能分化 I b 东大学博士学位论文 T H ES T U D YO F I S O L A T I O N ，C U L T U R E A N D D I F F E R E N T I A T I o No FN E U R A LS T E MC E L L SD E R E D F R O MT H ES P I N A LC o R DO FF E T A LR A T S A b s t r a c t s O b j e c t i v e s ：W et a k et h ea d v a n t a g eo ff l o a t i n gc u l t u r et
9、oi s o l a t e n e u r a ls t e m c e l l sf i - o ms p i n a lc o r do ff e t a lr a t s S t u d yt h e i rs e l f r e n e wa n dm u l t i p o t e n t i a lc a p a c i t yb y p a s s a g i n g t h e i rp r o g e n i e s M e t h o d s ： 1G e tm a t e r i a l sW ei s o l a t e dt h et i s s u em a s
10、so fs p i n a lc o r df r o me m b r y o n i c d a y1 3 ( E 1 3 ) u n d e r t h ea n a t o m i c a lm i c r o s c o p e 2 D i g e s t T h et i s s u em a s sw a s d i g e s t e d w i t h d i g e s ts o l u t i o n ( 1 3 4 m g m l h y a l i d a s e O 2 5 t r y p s i nl ：1 + O 2 m g m lk y n u r e n i
11、 ca c i m 。 3 D i s p e r s ea n dc u l t u r e T h et i s s u em a s sw a sd i s p e r s e dw i t hp i p e t t e s ，c e l l s w e r ei n o c u l a t e dw i t h3d i f f e r e n t d e n s i t i e s ( 4 1 0 4 t m l , 4 1 0 5 m la n d4 1 0 6 m 1 ) t o 2 4 一w e l lc u l t u r ep l a t ea f t e rt h en u
12、 m b e ro fv i t a lc e i l sh a db e e nd e t e r m i n e dw i t ht r y p a n b l u e T h ec u l t u r ec o n d i t i o ni s3 7 0 C ，s a t u r a t e dh u m i d i t y , 5 C 0 2 o p e nf l o a t i n gc u l t u r e w i t h o u ts u b s t r a t e T h ef o r m u l ao fc u l t u r es o l u t i o ni sD M
13、E M ( h i g h g l u c o s e ) F 1 21 ：1 、 E G F 1 0 n g u l 、b F G F1 0 n g u l 、B 2 72 ( V V ) 、g e n t a m y c i n1 0 0 u m l 。 4C o n v e n t i o n a lm e c h a n i c a l p a s s a g i n g T h e6 - 7 d a y s o l d p r i m a r y n e u r o s p h e r e s w e r et r i t u r a t e dw i t hf i r e p o
14、l i s h e dg l a s sp i p e t t e ，i n t h i s w a yt h e n e u r o s p h e r e sc o u l d b ed i s s o l v e di n t os i n g l ec e l l so r q u a r t e r so fs m a l l e rc e l lm a s s e s T h e p r o g e n yn e u r o s p h e r e sw e r e a l s od i s s o l v e di nt h i sw a y 5D i f f e r e n t
15、 i a t i o n 5 1D i f f e r e n t i a t i o ni nt h ev e r ys o l u t i o no fn e u r a ls t e mc e l l sC o v e r s l i p sp a s t e d w i t h p o l y i y s i n ew e r ec a s t e dt oc u l t u r ew e l l s ，o n l yt h es l i p sw i t hs i n g l en e u r o p h e r ew e r e 4 东大学博士学位论文 s e l e c t e
16、dt on e ww e l l sa n dc o v e r e dw i t ht h ev e r ys o l u t i o no fn e u r a ls t e mc e l l s I t s m i g r a t i o n , p r o l i f e r a t i o na n d d i f f e r e n t i a t i o nw i l lb er e c o r d e d 5 2E f f e c t so fs e r u mo nd i f f e r e n t i a t i o nE G Fa n db F G Fw e r er e m o v e df r o mt h e v e r ys o l u t i o no fn e u r a ls t e mc e l l s ，a d d i t i o n a l 1 0 c a l fs e r u mw a sc o n t m n e di n
