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1、朱俊铭朱俊铭 20112011年年1010月月 l l 生物技术药物生物技术药物 主要内容主要内容 绪论绪论 动植物细胞培养生产医药用产品或原料 动植物细胞培养生产医药用产品或原料 转基因动植物作为药物生物反应器转基因动植物作为药物生物反应器 抗体工程药物抗体工程药物 干细胞与治疗性克隆干细胞与治疗性克隆 基因工程疫苗与基因工程疫苗与DNADNA疫苗疫苗 基因药物基因药物 反义核酸与反义技术反义核酸与反义技术 生物技术药物新药与专利申报生物技术药物新药与专利申报 生物技术制药产业化个案生物技术制药产业化个案 l l 反义药物反义药物 主要内容主要内容 一、反义核酸与反义技术一、反义核酸与反义技
2、术 uu反义核酸和反义技术概念反义核酸和反义技术概念 uu反义核酸的基本原理反义核酸的基本原理 uu反义核酸的种类反义核酸的种类 uu反义核酸与反义技术的应用反义核酸与反义技术的应用 二、核酶技术及其应用二、核酶技术及其应用 uu核酶概述核酶概述 uu核酶与核酶与RNARNA修复修复 uu核酶技术在临床上的应用核酶技术在临床上的应用 uu核酶技术面临的问题核酶技术面临的问题 反义核酸和反义技术反义核酸和反义技术 uu反义核酸反义核酸(antisense nucleic acid)(antisense nucleic acid) 是一段与靶基因的某段序列是一段与靶基因的某段序列 互补的天然存在或
3、人工合成的核苷酸序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列 它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而在它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而在 转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设计转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设计 简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点 uu反义核酸技术（反义核酸技术（antisense nucleic acids technology)antisense nucleic acids technology) 是根据是根据 核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为
4、目的的核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的 一类核酸研究新技术一类核酸研究新技术 包括包括反义反义RNA(asRNARNA(asRNA) )、反义、反义DNA(asDNADNA(asDNA) ) 、核酶、核酶( (RzRz) ) 反义核酸的基本原理反义核酸的基本原理 uu绝大多数绝大多数DNADNA由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸 不同排列顺序编码在不同排列顺序编码在DNADNA链上，基因组形成单顺反子结构链上，基因组形成单顺反子结构 uu在在DNADNA双链上被转录为双链上被转录为RNARNA的链为正义链，与其相对应的链为
5、的链为正义链，与其相对应的链为 反义链反义链 uu精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，一般由精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，一般由7 7到到3030个核苷酸组个核苷酸组 成成，将会阻断基因转录；或将含有反义序列的载体导入细胞内，将会阻断基因转录；或将含有反义序列的载体导入细胞内， 干扰特定基因表达干扰特定基因表达 uu利用这一原理可以在基因位点、前体利用这一原理可以在基因位点、前体mRNAmRNA、 mRNAmRNA及蛋白水及蛋白水 平，通过干扰特定基因功能限制细胞增殖、分化和凋亡平，通过干扰特定基因功能限制细胞增殖、分化和凋亡 反义基因治疗反义基因治疗 DNA DNA RNA RNA 反义R
6、NA 阻断表达 uu 利用人工合成的反义利用人工合成的反义RNARNA或或DNADNA导入靶细胞，控制细胞导入靶细胞，控制细胞 的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为mRNA mRNA 或阻断或阻断 翻译相应蛋白翻译相应蛋白 反义技术的两种技术路线反义技术的两种技术路线 uu将表达与体内基因或将表达与体内基因或mRNAmRNA互补序列的基因转入体内，使细胞互补序列的基因转入体内，使细胞 表达与目标基因互补的表达与目标基因互补的mRNAmRNA，从而阻断目标基因的表达，从而阻断目标基因的表达 uu体外合成体外合成mRNAmRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等
7、途径进互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进 入细胞，特异性地与目标入细胞，特异性地与目标mRNAmRNA作用作用 uu以第二种为主来介绍以第二种为主来介绍 反义核酸的种类反义核酸的种类 uu反义反义RNARNA：一类能与特异：一类能与特异mRNAmRNA互补的小分子质量的、可扩散互补的小分子质量的、可扩散 的的DNADNA转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异 地抑制靶基因表达地抑制靶基因表达 uu反义反义DNADNA：人工合成一小段反义寡核苷酸，与：人工合成一小段反义寡核苷酸，与DNADNA或或mRNAmRNA序序 列互补结合，封
8、闭靶基因表达（列互补结合，封闭靶基因表达（ASODNASODN） 理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象“ “封条封条” ”一样，阻断一样，阻断 mRNAmRNA拼接、转录、翻译，下调特定基因表达拼接、转录、翻译，下调特定基因表达 反义反义RNARNA的最初发现的最初发现 uu反义反义RNARNA最先发现于原核细胞，是由最先发现于原核细胞，是由TomizarnaTomizarna在在 19811981年对质粒年对质粒ColE1ColE1复制的研究过程中发现的复制的研究过程中发现的 c-mycc-myc基因基因真核细胞中天然反义真核细胞中天然反义RNARNA
9、调节调节 uuc-mycc-myc基因是禽类髓细胞病毒基因是禽类髓细胞病毒(AMN)MC-29(AMN)MC-29的的V-V-mycmyc的细胞同的细胞同 源序列，与多种肿瘤发生发展有关源序列，与多种肿瘤发生发展有关 uuSaitoSaito等研究发现，等研究发现，c-mycc-myc基因有基因有3 3个外显子，第一个外显子不个外显子，第一个外显子不 编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义RNARNA与与 第二个外显子第二个外显子mRNAmRNA的碱基配对而抑制基因表达的碱基配对而抑制基因表达 uu在人在人BurkittBurkitt淋
10、巴瘤中发现淋巴瘤中发现c-mycc-myc基因失去了第一个外显子，从基因失去了第一个外显子，从 而使而使c-mycc-myc基因表达失控基因表达失控 uu由此可见，反义由此可见，反义RNARNA的负调节被解除是细胞恶性转变的原因之的负调节被解除是细胞恶性转变的原因之 一一 c-mycc-myc基因基因真核细胞中天然反义真核细胞中天然反义RNARNA调节调节 c-mycc-myc 互补互补 RNARNA C-MYCC-MYC 反义反义RNARNA的作用机制的作用机制 uu作用于外显子和内含子的连接区，阻止作用于外显子和内含子的连接区，阻止mRNAmRNA前体的剪接前体的剪接 uu反义反义RNAR
11、NA与与DNADNA结合时能阻止转录因子与结合时能阻止转录因子与DNADNA的结合，从而阻的结合，从而阻 止特定基因的转录止特定基因的转录 uu互补于特定互补于特定mRNAmRNA的非编码区，如的非编码区，如SDSD序列或核糖体结合位点及序列或核糖体结合位点及 其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译 uu互补于特定互补于特定mRNAmRNA的编码区，抑制翻译或激活的编码区，抑制翻译或激活RNaseRNase H H使使 mRNAmRNA易被核酸酶降解易被核酸酶降解 uu作用于靶作用于靶mRNAmRNA的的55端，阻止帽子结构形成，影响端，阻止帽子结构形成，
12、影响mRNAmRNA的成的成 熟熟 uu作用于作用于PoIyPoIy A A形成位点，阻止靶形成位点，阻止靶mRNAmRNA成熟及向胞浆内的转运成熟及向胞浆内的转运 反义反义RNARNA的作用机制的作用机制 DNA preRNA RNA Protein m7G5ppp AAAA rRNA 反义反义RNARNA的获得途径的获得途径 uu化学会成法化学会成法：利用核酸合成仪直接合成反义利用核酸合成仪直接合成反义RNARNA uu体外转录法体外转录法：利用带有噬菌体利用带有噬菌体SP6SP6或或T7T7等启动子序列的质粒，等启动子序列的质粒， 将特异基因的将特异基因的DNADNA片段反向插入其多克隆
13、位点中，在片段反向插入其多克隆位点中，在RNARNA聚合聚合 酶的作用下体外合成特异性反义酶的作用下体外合成特异性反义RNARNA uu细胞内转录法细胞内转录法：利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止 子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义RNARNA表达载体表达载体( (病病 毒表达载体或质粒表达载体毒表达载体或质粒表达载体) )，然后转染细胞并使之在细胞中稳，然后转染细胞并使之在细胞中稳 定表达反义定表达反义RNARNA 反义反义RNARNA的临床作用的临床作用 uu抗病毒：抗病毒： uu将特定的病毒基因反向插
14、入到表达性载体中，以构建反义将特定的病毒基因反向插入到表达性载体中，以构建反义RNARNA 表达载体表达载体 uu再将重组体导入真核细胞再将重组体导入真核细胞( (病毒宿主细胞病毒宿主细胞) )中表达特异性反义中表达特异性反义 RNARNA uu从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流 感病毒、人类免疫缺陷病毒）感病毒、人类免疫缺陷病毒） uu抗肿瘤：抗肿瘤： uu设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及 某些肿瘤相关病毒的癌基因反义某些肿瘤相关病毒的癌基因反
15、义RNARNA uu以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的 反义反义DNADNA与靶基因结合形式与靶基因结合形式 uu寡核苷酸与双股寡核苷酸与双股DNADNA结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活 转录蛋白与基因启动子结合，发挥其生物活性转录蛋白与基因启动子结合，发挥其生物活性 uu寡核苷酸与寡核苷酸与mRNAmRNA杂交形成了核糖核苷酸酶杂交形成了核糖核苷酸酶H(RNaseH(RNase H) H)底物，底物， 激活激活RNaseRNase H H识别杂交体特异性地剪切杂交分子中的识别杂交体特异性地剪切杂交分
16、子中的mRNAmRNA RNase HRNase H ASODNASODN mRNAmRNA TFO 反义寡聚核苷酸与反义寡聚核苷酸与 mRNAmRNA特异性结合，特异性结合， 阻断翻译过程阻断翻译过程 ANTISENSE ANTISENSE TECHNOLOGIESTECHNOLOGIES GENOMICS BASED GENOMICS BASED DRUG DISCOVERYDRUG DISCOVERY PHARMACEUTICALSPHARMACEUTICALS MOLECULAR MOLECULAR DIAGNOSTICSDIAGNOSTICS GENE THERAPYGENE THERAPY DRUG DELIVERY DRUG DELIVERY SYSTEMSSYSTEMS Relation of antisense technologies to other segm
