分子生物学讲述

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1、MicRORNA-339-5p/3p 在结直肠癌中 作用的研究 结直肠癌症简介 常见的消化道恶性肿瘤，好发部位为直肠及直肠 与乙状结肠交界处。 早期： 便血和排便习惯改变 中、晚期： 除食欲不振、体重减轻、贫血等全身症状外，尚 有排便次数增多，排便不尽、便意频繁、里急后重等 癌肿局部刺激症状。癌肿增大可致肠腔狭窄，出现肠 梗阻征象。 50的miRNAs编码序列定位于 肿瘤相关的基因组区域或脆性 位点中，提示了miRNAs可能与 肿瘤的发生、发展、演进密切 相关 对比早期结直肠癌患者组织与晚 期复发患者组织的MicroRNA芯 片结果显示：期结直肠癌患者 组织的miR-339-5P表达水平相对

2、于期结直肠癌患者组织呈现下 降趋势 miR-339-3p/5p是pre-miRNA 转转运到细细胞质质被Dicer酶切后 形成的两条互补补的MicroRNA. 从功能方面分析就是两条不同 的MicroRNA,分别调别调控一些靶 基因表达 结直肠癌与microRNA 因此miR-339-3p及miR-339-5p在结直肠癌发生发展中的作用及其分子机 制值得我们深入探讨。 本课题实验方法 实时定量PCR技术的方法，检测 miR-339-3p及miR-339-5p在结直 肠癌组织和细胞株中表达特性。 A 利用RNA干扰技术及构建miRNAS过表达 慢病毒载体，通过CCK-8、细胞周期、细 胞迁移和侵

3、袭、裸鼠皮下成瘤等实验检测 miR-339-3p及miR-339-5p对结肠 癌细胞 的增殖及转移能力的影响。 B 1、细胞培养 人结直肠癌细胞株 SW480,HCT116,LS174T,HT 129, SW620,LOVO 2、RNA的提取 （1）组织标本RNA的提 取 （2）细胞RNA的提取 4、荧光定量PCR反应 以cDNA为模板，U6RNA为内对 照，检测配对结直肠癌组织和个 细胞株中miR-339-3p及miR-339- 5p的相对表达水平(癌旁正常组 织为对照组，癌组织和其余细胞 系为实验组) 3、逆转录反应 以总RNA为模板，逆转录成 cDNA 实验方法 结直肠癌中miR-339

4、-3p及miR-339-5p的表达特性的鉴定 本研究检测的miR-339-3p及miR-339-5p在癌组织的表达低于相应的癌旁组织，在细胞株中的表达 低于正常组织。 （ SW480,HCT116,LS174T,HT129均源自原位大肠腺癌，而SW620,LOVO均从结直肠癌转移灶中 获得。） 研究结果显示miR-339-3p及miR-339-5p在低转移能力的SW480,HCT116,LS174T,HT129细胞中的 表达明显高于高转移能力的SW620,LOVO细胞，提示其在细胞肿瘤恶性行为的维持中发挥着重要的作 用。 miR-339-3p及miR-339-5p对结直肠癌细胞体内外生物学特性

5、的影响 转转染miR-339-3p mimics 及miR-339-5p mimics 和 miR-339-3p inhibitor及 miR-339-5p inhibitor， 研究miR-339-3p及miR- 339-5p在结结直肠肠癌细细胞中 表达升高或表达降低对结对结 直肠肠癌细细胞体外生物学行 为为的影响 对体外生物学特性 的影响 构建慢病毒表达载载体 ，利用裸鼠动动物模型 检测检测 的方法研究miR- 339-3p及miR-339-5p 表达升高对结对结 直肠肠癌 细细胞体内生物学行为为 的影响 对体内生物学特性 的影响 miR-339-3p及miR-339-5p对结直肠癌细胞体

6、外生物学特性的影响 1 HCT116和 SW620细胞培 养 2 转染试剂制备 3 细胞的RNA提取 及荧光定量PRC 检测 4 体外功能实验实验 （ 1）CCK8细细胞增殖实验实验 （2）采用流式细细胞术检测术检测 细细胞周期 （3）Transwell小室体外迁 移实验实验 （4）Transwell小室体外侵 袭实验袭实验 体外功能实验结果 结果显示：过表达miR-339-3p及miR- 339-5p抑制SW620细胞体外增殖能力 结果显示：miR-339-3p inhibitor 及miR-339 -5p inhibitor 转染后促进HCT116细胞体外增 殖能力 结果显示：miR-33

7、9-5p mimics 转染后使SW620细胞 停滞在G1期。 miR-339-3p mimics 转染后对SW620细胞周期分布无 明显影响。 结果显示：miR-339-5p inhibitor转染可促 进HCT116细胞S期比例增多。 miR-339-3p inhibitor转染对HCT116细胞 G1、S期的分布无明显影响。 结果显示：过表 达miR-339-5P及 miR-339-3P抑制 SW620细胞体外 侵袭能力 结果显示：抑制 miR-339-5P及 miR-339-3P能促 进HCT116细胞侵 袭能力 结果显示：过表 达miR-339-5P及 miR-339-3P抑制 SW

8、620细胞体外 迁移能力 结果显示：miR- 339-3p inhibitor 及 miR-339-5p inhibitor 转染后促 进HCT116细胞体外 增殖能力 miR-339-3p及miR-339-5p对结直肠癌细胞 体外生物学特性的影响 显著抑制人结直肠癌细胞的增殖、侵袭 miR-339-3p及miR-339-5p对结直肠癌细胞体内生物学特性的影响 采用构建慢病毒表达载体（PLVTHM-pre-miR-339)，转染sw620细胞，筛选出 稳定细胞株（稳定细胞株命名为sw620/PLVTHM-pre-miR-339）。使用了经典 的肿瘤异体异位动物模型一裸鼠皮下移植瘤模型来观察稳转

9、miR-339-3p及miR- 339-5p的sw620细胞在体内形成肿瘤的情况. 我们主要通过观察肿瘤形成速度与体积，来确定稳定过表达miR-339对结肠癌 细胞体内生物学行为的影响. miR-339上下游侧翼 序列的克隆 02细胞培养01 筛选建立稳定过表达 miR-339的结直肠癌细 胞株 04慢病毒的包装03 动物实验06体外功能实验05 实验步骤 A B C 稳定过表达miR-339抑制 sw620细胞增殖能力 转染PLVTHM-pre-miR-339 可使sw620细胞停滞在G1期 稳定过表达miR-339抑制 sw620细胞迁移、侵袭能力 体外功能实验结果 皮下成瘤实验 miR-

10、339-3p及miR-339-5p对结直肠癌细胞体内生物学特性的影响 稳定过表达miR-339抑制人结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭 构建病毒载体，筛选稳定细胞株，注入裸鼠体内，可延缓肿瘤细 胞的增殖，却促进肿瘤在裸鼠体内的转移 体内生物学实验 体外生物学实验 miR-5p及miR-3p这这两种来 源于同一前体的成熟microRNA可以作 用于相同的靶基因，发挥发挥 相同的作用， 也可以作用于不同的靶基因，分别别扮演 癌基因或抑癌基因的角色。 结论：microRNA-339作用 microRNA-339-5p及microRNA -339-3p均可以发挥抑癌基因 的作用，抑制结肠癌细胞增殖 与转移

11、的恶性行为。 流式细胞仪（FCM）又称荧光活化细胞分拣器，是一种用于测定放射性染色体的新技术。用FCM通过测定细胞 中DNA含量而进行细胞周期分析。测定DNA含量后，可用FCM配备的细胞周期分析软件对其进行自动分析。此测定的细 胞周期按照DNA的量分为G0/G1期，S期和G2/M期。 培养MG63细胞在 6孔板内依次放入 对照组和3个实验 组钛片各40片， 培养至细胞会和 后，每孔加矿化 液2.5ml。分别培 养3、5、10、15 天后，每组取5个 钛片移至新的6孔 板内，将钛片表 面细胞消化离心 收集 01 PBS清洗 消化收集 23次， 调整细胞 密度为 1x106个 /ml 02 将细胞

12、 悬液 100ul转 移到试 管中 03 加入FITC 标记的 annexinV 和PI溶液 ，轻轻混 匀 04 室温避光 放置10- 15分钟 05 加入400ul 缓冲液， 将全部液 体转入 FCM 06 流式细胞仪（FCM） 尽快进行 FCM分析 。并统计 细胞周期各 个时期所占 比例和凋亡 细胞百分比 07 裸鼠实验模型 动物肿瘤移植模型常采用昆明种小鼠或纯种小鼠接种小鼠肿瘤，观察受试物对肿瘤生长的抑制 作用。小鼠肿瘤移植瘤模型具有实验周期短，重复性好，所需空间小，费用相对较低等优点， 因此曾经广泛使用。 在抗肿瘤药物药效学的有效性及可靠性评价中，体内试验采用人癌异体移植模型，人癌异体

13、移 植模型试验通常在无胸腺鼠或联合免疫缺陷小鼠体内移植人癌细胞系，观察受试物对肿瘤生长 的抑制作用。 裸小鼠为纯合子，表现为无毛，无胸腺。由于其胸腺先天性缺陷，T细胞缺乏，易于接受异种 移植。但也由于其免疫功能低下，易受微生物的感染，在常规条件下不易存活，平均寿命仅30 天左右。在无菌条件下，裸小鼠的寿命可接近普通正常小鼠。裸小鼠最理想的饲养方式是按无 菌动物（germ free）条件饲养，但这种条件一般无法达到；其次是在无特殊病原（specific pathogens free, SPF）条件下饲养。 1969年丹麦学者Ryaard首次将人结肠癌移植于裸小鼠获得成功，这是首例人类肿瘤异种移植成 功。现在裸小鼠已被公认为人癌模型的理想动物和重要工具，有“活试管”之称。这种人癌的 异种移植，一般不需对动物附加任何处理，肿瘤即得以生长，并可以在体内长时间传代而保持 其原有的生物学特性。 由于人癌异体移植模型与临床疗效之间的相关性较强，通常情况下，以人癌异体移植模型试验 结果来评价抗肿瘤药物的有效性及可靠性。 THANK YOU VERY MUCH！