淋巴细胞的分化成熟和受体的基因表达_生物化学与分子生物学

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1、 1、糖组学(glycomics) 的背景及研究意义 20 世纪纪末,继继基因组组学、蛋白质组质组 学之后,糖组组学也日益受 到人们们关注。顾顾名思义义,糖组组学是对对糖链组链组 成及其功能研究 的一门门新学科,是基因组组学的后续续和延伸,具体内容包括研究 糖与糖之间间、糖与蛋白质质之间间、糖与核酸之间间的联联系和相 互作用,其主要研究对对象为为聚糖。丰富多样样的聚糖覆盖了生 物有机体的所有细细胞,不仅仅体现细现细 胞的类类型和状态态,也参与了 许许多生物学行为为,如细细胞发发育、分化、肿肿瘤转转移、微生物感 染、免疫反应应等;聚糖还还体现现生物和分子的进进化作用,如糖酵 解、生物合成的保守性

2、以及核糖的起源等。 示例： 糖链的生物学功能 （1）糖链在糖蛋白新生肽链折叠和缔合中的作用 研究表明：糖蛋白N-糖链在参与新生肽的折叠，维持蛋白 质正确构象时起重要作用。 红细胞血凝素，如N-糖链 缺乏,则不能折叠呈三聚体 （2）糖链影响糖蛋白的分泌和稳定性 免疫球蛋白如缺乏N-糖链则不 能分泌到胞外而留在内质网中 （3）糖链参与分子识别和细胞识别 血清中很多蛋白质质式含有以唾液酸残基为为末端的N-糖链链糖 蛋白，称唾液酸糖蛋白，如免疫球蛋白、蛋白质质激素，载载体蛋白 等。 如被唾液 酸酶降解 与肝细细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体结结合 胞吞作用并降解 与血浆中老蛋白的清除有关 与精卵识别识别

3、有关 受精是精子与卵子的 融合。哺乳动动物的卵子外 面有一层层透明的糖蛋白外 衣，称透明带带（zone pelluci da,ZP)。透明带带由 ZP-1、ZP-2和ZP-3三种糖 蛋白组组成,受精中起主要作 用的是ZP-3,连连接在ZP-3 上的O -GalNAc糖链链能被 精子表面上的凝集素受体 识别识别 (有物种特异性)。O - GalNAc糖链链的非还还原端 是一个一连连接的半乳糖 残基,它可能在精卵识别识别 中 起关键键作用。 与细胞粘着有关 细细胞粘着(cell adhesion)是进进化中随着多细细胞生物出现现的 必然现现象。多细细胞生物中细细胞有相互识别识别 而聚集成细细胞群的

4、能 力细细胞粘着。细细胞群或组织组织 (tissue)中细细胞与细细胞之间间充满满 着由糖蛋白(胶原蛋白、纤连纤连 蛋白、层层粘蛋白)、蛋白聚糖、透明 质质酸等组组成的胞外基质质(extracellular matrix,ECM)。在整个生 物体中,ECM形成一个连续连续 的主体网络结络结 构,所有的细细胞都交织织 或浸泡在这这一网状基质质中,网络络中细细胞一细细胞粘着,细细胞一ECM 粘着都是通过过有关的膜内在蛋白质质(integral membrane protein)完成的。这这些膜蛋白称细细胞粘着分子(cell adhesion molecule, CAM)或粘着蛋白,包括整联联蛋白(

5、integrin),钙钙粘着蛋 白(cadher -in)免疫球蛋白超家族(Ig superfamily),血管地址素 (vescular addressin) 选择选择 蛋白(selectin)等。CAM 绝绝大多数都 是含N一糖链链的糖蛋白.例如整联联蛋白是由一和一亚亚基组组成的 异二聚体,两个亚亚基上有多个N一糖基化位点。去糖链链的整联联蛋白 完全失去与纤连纤连 蛋白的粘着能力。 （4）糖链影响糖蛋白的生物学活性 糖链与酶活性 糖链在酶的新生肽链折叠、转运和保护等 方面普遍起作用。但糖链与成熟酶活性的关 系因酶而异。有些酶除去糖链活性不受影响, 如UDP-葡糖醛酸酶、酵母羧肽酶等。有些酶

6、 的活力依赖其糖链的存在， 如溶酶体一葡糖 苷酶除去糖链后只有免疫活性而而完全没有 酶活力。 糖链与激素活性 糖蛋白激素主要有腺垂体促激素类包括FSH(促卵泡激素 ),LH(促黄体生成激素)和TSH(促甲状腺 激素)以及胎盘绒毛膜 促性腺激素和肾脏红细胞生成素(erytlmpoietin,EPO)等。 FSH、LH和TSH均由亚基和亚基组成,两个亚基都有N一糖 链。糖链呈高度不均一性,例如LH和TSH中精链的外链末端有 些为SO4-4GalNAc 1，有些为Sia 2 3Gal 1,而FSH中 的糖链都是以 Sia 2 3Gal 1为末端的。已经证明，带 有SO4-4GalNAc 1末端结构的

7、激素对受体的亲和力比带有 Sia 2 3Gal 1末端的激素高，但在体内的半寿期前者比 后者短,因为在肝脏网状细胞表面有特异结合SO4-4GalNAc 1为末端的糖链的受体,而Sia为末端的糖链则必须经唾液酸 酶水解除去Sia从而暴露Gal后才能被半乳糖结合受体识别并清 除。 糖链与IgG 活性 每分子IgG 均含糖链约链约 三条，几乎全部N一糖链链都是复杂杂型, 非还还原末端残基为为Sia或Gal(去Sia),少数为为GlcNAc(去Sia-Gal), IgG的N-糖链链多达30余种,呈高 度不均一性。如IgG的N一糖链链缺 失外链链Gal (这这种糖链链称G0 糖链链）后,可成为为一种自身

8、抗原,被免 疫系统识别统识别 而产产生自身抗体。后者能与带带有Go糖链链的Ig G生成 免疫复合体，沉积积于关节节腔内,引起炎症。这这种免疫复合体是由 带带Go糖链链的IgGFc段(作为为抗原)和带带末端Sia的IgG(作为为抗体 )Fab段结结合而成,实际实际 上是IgG的自身聚合物。类风类风 湿性关节节炎 、红红斑狼疮疮等都是一种与IgG的糖链结链结 构改变变有关的自身免疫 病(autoimmune disease)。 类风湿关节炎 总 之 毫无疑问问,如果试图试图 深入了解生命的复杂杂 规规律,就必须须有“基因组组蛋白质组质组 糖组组 ”的整体观观念,这样这样 才有可能揭示自身全部 基因

9、功能,从而进进一步深入研究疾病的发发病 机制,有效控制疾病的发发生、发发展及预预后, 以及筛选筛选 疾病、预测诊预测诊 断标记标记 物和开发发 新的药药物靶标标。 2、糖组学的研究策略 糖组组学的研究远较远较 基因组组学、蛋白质组质组 学复杂杂。 目前糖组组学关注的焦点是糖蛋白,为为了更好地与蛋白质组质组 学相 关联联,将研究对对象锁锁定为为糖肽肽。研究核心策略为为: (1) 分析单单物种生物所产产生的所有聚糖; (2) 以糖肽为肽为 研究对对象确认编码认编码 糖蛋白的基因; (3) 结结合有效的理化和生化性质质,研究糖蛋白糖链链的性质质。 研究的重点在于: (1) 编码编码 糖蛋白的基因;

10、(2) 实际实际 糖基化的位点; (3) 聚糖结结构; (4) 糖基化的作用。 主要分为为三大部分: 结结构糖组组学、功能糖组组学以及生物信息 学;其中结结构糖组组学主要包括“糖捕获获”技术术、前沿亲亲和层层析技 术术等,功能糖组组学主要包括微阵阵列技术术等。 3、糖组学研究技术进展 1）结结构糖组组学 根据与糖链连链连 接方式不同,蛋白质质主要有N连连接 和O连连接两种糖基化形式: 前者是糖链链与蛋白 AsnXXXSer/Thr 序列子(XXX 为为除脯氨酸以 外的氨基酸) 中Asn 残基上的 NH2 相连连;后者 则则是糖链链与蛋白Ser/Thr 残基上的OH 相连连。 N连连接和O连连接

11、糖蛋白主要定位于细细胞膜表 面,也可以分泌型蛋白的形式存在。此外,糖蛋白 还还有GPI锚锚定蛋白和近年来在细细胞核和细细胞质发质发 现现的OGlcNAc（N-乙酰酰氨基葡萄糖 ）修饰饰蛋 白两种存在形式。 A、 N糖链 N-糖链的共同结构花式：核心五糖 Glc-葡萄糖；Gal-半乳糖；Man-甘露糖 ；Fru-果糖 Rib-核糖；Fuc-岩藻糖；Sia-唾液酸；GlcA-葡糖酸 GlcUA-糖醛酸；GlcNAc N-乙酰葡萄糖胺； GalNAc N-乙酰半乳糖胺；NeuNAc N-乙酰神经氨酸 N-糖链的分类 复杂型N-糖链的分支 B、 O糖链 特点：与N-糖链相比结构简单，但连接形式多。 几

12、种糖蛋白的寡糖链 小 结 糖链结链结 构信息包括糖链链的单单糖组组成、异头头 碳构型、糖苷键键的连连接位置和糖残基的序 列分析等内容。糖蛋白糖链链的结结构分析包 括糖蛋白的提取分离、糖链释链释 放和糖链结链结 构鉴鉴定等多个步骤骤。 （1）糖蛋白的提取和分离纯化 糖蛋白多定位于细细胞表面,属于膜蛋白,水溶性不 好,其有效提取是糖组组学糖链结链结 构研究的瓶颈颈之 一。目前常采用先制备质备质 膜,然后用CHAPS 等去 污剂释污剂释 放或Triton X114 相分离、有机溶剂剂萃 取等方法提取糖蛋白。获获得的糖蛋白主要采用透 析、超滤滤、电电泳和层层析等方法来分离纯纯化,其中 由几种不同类类型

13、凝集素亲亲合柱组组成的序列凝集素 亲亲合层层析(serial lectin affinity chromatography, SLAC) 法是较较好的方法。 SLAC 研究发现发现 ，植物凝集素是一类类能选择选择 性地结结合糖链链的糖结结 合蛋白。利用这这种特性可以特异性地富集某种糖蛋白/糖链链 。用于纯纯化糖蛋白/糖链链的植物凝集素主要有刀豆凝集素 (concanavalin A, Con A)、麦胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)、豌豆外源凝集素(pea lectin)、植物血 凝素(phytohaemagglutinin-E4 ,E4-PHA) 和网孢盘孢盘

14、 菌凝集 素(Aleuria aurantia lectin,AAL)等。单单一一种凝集素并不 能够够富集细细胞中所有的糖蛋白/糖链链，因此科学家们们在上世 纪纪80年代发发明了一种被称作连续连续 凝集素亲亲和色谱谱(serial lectin affinitychromatography, SLAC)的方法来分离同一 细细胞中的各种糖蛋白/糖链链。这这种方法是将不同的凝集素亲亲 和柱串联联排列，样样品混合物依次经过这经过这 些亲亲和柱，这样这样 就 可将不同的糖蛋白/糖链链富集在不同的柱中，提高了糖蛋白/ 糖链链的回收效率和混合糖蛋白/糖链链的分离效果。 The lectins tested

15、 recognize the following residues: -D-galactosyl Ricinus communis agglutinin 120, (RCA- 1) and peanut agglutinin, (PNA); -D-galactosyl Griffonia simplicifolia agglutinin (GSA); -D-mannosyl-D- glucosyl concanavalin A (ConA) and Lens culinaris agglutinin (LcH); N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acid

16、Limax flavus agglutinin (LFA) andLimulus polyphemus agglutinin (LPA); N-acetyl-glucosaminyl and sialyl wheat germ agglutinin (WGA); N-acetyl-D-galactosaminyl Helix pomatia agglutinin (HPA) and Dolichos biflorus agglutinin (DBA) and -L- fucosyl Ulex europeus agglutinin (UEA-1). （2）糖链的释放 纯纯化后的糖蛋白样样品即可进进行糖链释链释 放。糖链释链释 放一般 有化学释释放和酶释释放两种方法。 化学法主要有肼肼解法和消除法,前者可释释放糖蛋白