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1、微生物学两大经典染色： 革兰氏染色法 抗酸染色法 革兰染色法 革兰氏染色法是1884年由丹麦病 理学家汉斯克里斯蒂安革兰 （Hans Christain Gran ）创立的。 实验目的和要求 1. 掌握革兰氏染色方法的操作步骤及 注意事项。 2. 了解革兰氏染色的临床意义。 一、实验原理 二、实验器材 三、操作步骤 四、注意事项 五、革兰染色的临床意义 （一）基本步骤： 1、初染：草酸胺结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色 4、复染：石炭酸复红复染 一、实验原理 细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它 们细胞壁的成分和结构不同而造成的。 初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝 紫色。 碘
2、作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结 晶紫碘的复合物，增强染料与细菌的 结合力。 （二）原理： 当用脱色剂处理时，G+菌的细胞壁主要由肽聚糖 形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用 乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构 孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的复合 物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后 仍保留初染剂的蓝紫色。 G-菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂 质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶 解，细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比 较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染 上复染剂的红色。 细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为G+菌； 细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复
3、染剂的颜色 （红色）的细菌为G-菌。 G-G + 二、实验器材 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革 兰氏染色液，生理盐水，载玻片，接 种环，显微镜等。 三、操作步骤 1、涂片：将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别 涂片、干燥、固定。 2、染色： （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟 ，水洗 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分 钟，水洗 （3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用 95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约2030秒，立 即用水冲净乙醇 （4）复染：用番红液染1-2分钟，水洗 3、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细 菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌 呈红色。 四、注意事项 1、注
4、意涂片不宜过于浓厚。 2、火焰固定温度要适宜。 3、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如 脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳 性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多 少等因素的影响，难以严格规定。 4、染色过程中应吸去玻片上的残水，以免染色 液被稀释而影响染色效果。 5、选择幼龄的细菌。G+菌培养12-16h，E.coli 培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使 G+菌转呈阴性反应。 五、革兰染色的临床意义 1.对细菌的鉴别有重要意义 2.指导临床选择用药 3.研究细菌与致病性的关系 思考题： 当你对一株未知菌进行革兰染色
5、时 ，怎样能确证你的染色技术操作正确 ，结果可靠？ 抗酸染色法 【原理】 结核杆菌对苯胺染料不易着色，若加温或 延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒 精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核 杆菌及其它分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸 菌和细胞杂质等呈蓝色。 【材料】 结核病人的咳痰液：采取清晨第一口粘 痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。 石炭酸复红染色液，3%盐酸酒精，碱性 美蓝染液 生理盐水 载物玻片，滤纸片、接种环、玻片夹、 酒精灯、蜡笔等 【方法】 1涂膜 痰的涂片：用灭菌的接种环采取痰中干酪 坏死的小块或带血的痰液，在载玻片上涂 成薄而均匀的膜（在烧接种环时为防止痰 中的细菌溅出，可先将接种
6、环在内焰烧干 ，然后再于外焰中灭菌）。 2染色 （1）在已固定好的涂片上放置滤纸片（滤纸的作用是 滤去染液中的沉渣，使标本清晰），滴加石炭酸变红染色 液于滤纸片上（应滴满滤纸片）。 （2）将加有染液的涂片加温，在火焰上保持一定的高 度，直到出现蒸汽（不得沸腾）如此反复23次（约5分 钟）。在加温过程中防止将染液烘干（应及时添加染液） 。 （3）去掉滤纸片，使涂片冷却，水洗。 （4）用3%盐酸酒精脱色，直到流下的脱色剂无色为 止，水洗。 （5）用碱性美蓝染液复染30秒，水洗、干燥、镜检。 【结果观察】 1.结核杆菌染成红色，细长，直的或为微 弯曲，有的可表现出分枝特征，偶而有着 色不匀，成颗粒状者。亦可以见到有纵行 条索状排列。标本的其余部分及非抗酸性 细菌染成蓝色。必须逐一观察各个视野， 直待全部涂片找不到结核杆菌时，才可报 告阴性。 2.涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要 每ml痰液内含菌量至少应有500个以上， 甚至需达到5万以上。故材料多进行浓缩集 菌处理，以提高检出阳性率，也造成在染 色标本片观察中，不一定每个视野都能看 到结核杆菌。 3.结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临 床治疗后标本材料中，结核杆菌往往菌体断 裂，或形成非抗酸性革兰氏阳性的短杆状、 球状颗粒，亦称Much颗粒。 4.标本经高压灭菌处理，不影响染色结果， 也保证操作者的安全。
