噬菌体与杂菌的防治.

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1、5 噬菌体与杂菌的防治 在发酵工业中常存在噬菌体和杂菌的污染，噬菌 体污染会使生产菌发生自溶而危害生产。杂菌污染 消耗大量营养，破坏原有营养条件，导致生产菌营养 不足；产生代谢产物改变环境的理化条件，抑制生 产菌形成产物；破坏发酵产物或将其当营养消耗而 造成目的产物损失。因此，污染直接影响发酵产物的 产量，甚至导致倒罐而一无所获。染菌还会影响产物 的提取从而影响产品质量。由此可见，控制谷氨酸发 酵生产，必须防止噬菌体与杂菌污染，只有杜绝污染 才能实现发酵工艺的最优化控制。 5.1 谷氨酸发酵中噬菌体的污染与防治 噬菌体是侵染细菌、放线菌等微生物 并使其细胞裂解死亡的一类病毒。它个体 微小，必须

2、用电子显微镜才能观察到。噬 菌体无细胞结构，但具有一定的形态结构 。其基本形态为蝌蚪状、微球状和丝状， 多数呈蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成 。 有的味精厂往往由于发酵污染噬菌体而 造成倒罐，使生产紊乱，甚至短期停产。多 年来，国内外味精生产厂商都很重视对噬菌 体的防治工作，并采取了一系列防治措施， 使噬菌体污染得到基本控制，污染程度也逐 步减轻，但尚未达到根治。往往轻度的噬菌 体污染也会使正常生产受到困扰，并使产率 下降，成本升高，对企业效益影响很大。所 以，对噬菌体的防治仍然是发酵工业普遍关 注的问题。 1961年在我国台湾的谷氨酸发酵工厂 中最早发现噬菌体，其后1963年在日本的 八代工

3、场，乳糖发酵短杆菌No.2256即 ATCC13869菌株发生溶菌现象，并从发酵 罐中分离出P系噬菌体，从空气中分离出 AP系噬菌体。我国是在1966年发现黄色 短杆菌和北京棒杆菌AS1.299菌株污染并 分离出A系噬菌体。 噬菌体的本质 噬菌体是病毒的一种，是一种极微小 的生物，可能通过细菌过滤器，只有在电 子显微镜下才能看到；能够繁殖，具有非 常专一寄生性，可以认为是细胞以外的一 种分子生物。 噬菌体的化学组成 绝大部分是DNA和蛋白质，占噬菌体重 量的90%以上。少数为RNA。 5.1.1 噬菌体的化学组成 l核 酸 绝大部分是DNA，少数是RNA. l蛋白质 外壳 l核酸和蛋白质占总质

4、量的90%以上 5.1.2 噬菌体的形态 从形态学上可将噬菌体分为六群 噬菌体的形态和构造噬菌体的形态和构造 在电子显微镜下可以观察到在电子显微镜下可以观察到 噬菌体的形态，其形态有蝌噬菌体的形态，其形态有蝌 蚪形、微球形和纤维形等六蚪形、微球形和纤维形等六 种，以蝌蚪形为大多数。谷种，以蝌蚪形为大多数。谷 氨酸产生菌的噬菌体基本上氨酸产生菌的噬菌体基本上 是蝌蚪形。已发现的谷氨酸是蝌蚪形。已发现的谷氨酸 产生菌如乳糖发酵短杆菌和产生菌如乳糖发酵短杆菌和 产氨小杆菌所感染的噬菌体产氨小杆菌所感染的噬菌体 都是多面体头部和不短的尾都是多面体头部和不短的尾 部。头部长部。头部长50200nm502

5、00nm，宽，宽 50200nm50200nm，尾部长，尾部长 250600nm250600nm。噬菌体直径为。噬菌体直径为 0.1m0.1m，为细菌大小的，为细菌大小的1/101/10 ；体积是细菌的；体积是细菌的1/10001/1000。 表5-1 噬菌体的形态 类 型 形 状 结 构核酸噬菌体 1蝌蚪形六角形头部可收缩性尾 部 dsDNAT2,T4,T6 2蝌蚪形六角形头部非收缩性长 尾 dsDNAT1,T5, 3蝌蚪形六角形头部非收缩性短 尾 dsDNAT3,T7 4微球形六角形头部12个顶角各 有一个较大壳粒 ssDNAX174 S13 5微球形六角形头部12个顶角各 有一个较小壳粒

6、 ssRNAf2, Q, MS2 6丝 状丝状(线状)ssDNAM13 细胞壁 5.1.3 谷氨酸发酵中的噬菌体 目前我国谷氨酸发酵中所发现的噬菌 体，均属蝌蚪形。 5.1.4 噬菌体的生活史 吸附 侵入 复制成熟 释放 噬菌体缺乏独立代谢的酶系，不能脱离寄主而自行生长噬菌体缺乏独立代谢的酶系，不能脱离寄主而自行生长 繁殖；缺乏细胞结构，是非细胞类型。它的生长繁殖包括吸繁殖；缺乏细胞结构，是非细胞类型。它的生长繁殖包括吸 附、侵入、复制和成熟四个阶段。附、侵入、复制和成熟四个阶段。 5.1.4.1 吸附 l噬菌体的吸附器官 与受体细胞特殊位点 的接触。对于T类噬 菌体的吸附器官是尾 丝和尾钉，

7、尾丝首先 触及寄主细胞表面， 然后尾钉固定。 l寄主的专一性和吸 附位点的专一性。 吸附吸附 敏感的细菌细胞壁上具有吸附噬菌体的特异性受点，噬敏感的细菌细胞壁上具有吸附噬菌体的特异性受点，噬 菌体尾部由此吸附侵入。在吸附时，一般必须存在菌体尾部由此吸附侵入。在吸附时，一般必须存在CaCa2+ 2+、 、MgMg2+ 2+ 等阳离子。等阳离子。 CaCa2+ 2+、 、MgMg2+ 2+是噬菌体的激活剂和吸附剂，促进噬菌 是噬菌体的激活剂和吸附剂，促进噬菌 体的吸附作用，而体的吸附作用，而FeFe2+ 2+、 、CuCu2+ 2+对吸附有抑制作用。 对吸附有抑制作用。 5.1.4.2 侵入 l噬

8、菌体核酸物质进入 受体细胞。 l对T类噬菌体就开始收 缩尾鞘，结果不仅尾髓 插入细胞壁，而且会像 注射一样将DNA打入细 胞内。蛋白质的外壳仍 在壁外，而线状噬菌体 fd则全部进入寄主细胞 。 侵入 噬菌体尾部的前端含有溶菌酶类，当吸附后尾髓贯通细 胞壁，尾鞘收缩，将头部的DNA（或RNA）射入细胞内。从吸附 到侵入时间很短，一般只要几分钟。 5.1.4.3 复制 噬菌体核酸物质及蛋白质在寄主细胞内的合成 噬菌体的DNA进入细胞后，起着支配的作用，大量复制子代噬 菌体的DNA以及噬菌体的蛋白质，并形成完整的噬菌体。 5.1.4.4 成熟(装配) l在增殖期合 成的噬菌体的 核酸和蛋白质 按一定

9、的顺序 装配成噬菌体 颗粒。 成熟 噬菌体DNA的合成从感染后57min开始，其速率竟为细菌本 身DNA合成的510倍。810min时头部蛋白质、尾髓、尾鞘、尾丝 等合成依次开始，1012min在细胞内开始出现成熟的噬菌体。 5.1.4.5 释放 l噬菌体繁殖的最后 阶段是裂解释放出子 代噬菌体。裂解细胞 要涉及两个或更多基 因的作用,一个作用 于细胞膜，另一个分 解细胞壁,线状噬菌 体则不裂解寄主细胞 ，可能是通过挤压而 冲出细胞壁。 从吸附到放出时间叫潜伏期，一般为30120min。 每个细胞放出的噬菌体的平均数约为8150个。 5.1.5 典型的噬菌体一步生长曲线 5.1.6 潜伏期、潜

10、隐期、裂解期、裂解量 潜伏期 从噬菌体吸附细 菌细胞至细菌细胞释 放出新的噬菌体的最 短时间。 潜隐期 从噬菌体吸附细 菌细胞到细胞内从新 出现噬菌体的颗粒的 最短时间。 l 裂解期 从被感染的第一个细胞 裂解至最后一个细胞裂解完 毕所经历的时间。 l 裂解量 每种噬菌体侵入敏感细 胞，平均每个细胞最后能装 配完成和释放出的噬菌体数 称为裂解量，它是相对固定 的。 5.1.7 裂解量的计算公式 a 裂解期末平均噬菌斑数 b 潜伏期平均噬菌斑数 裂解量=a/b 5.1.8 噬菌体的检测方法 单层平板法 双层平板法 液体培养检查法 平板交叉划线法 载玻片快速法 增殖检查法 快速检测法 小剂量剌激检

11、查法 噬菌斑 在细菌菌苔平板上，由于噬菌体感染，使寄主细胞不断裂解 而形成的肉眼可见的空斑。空斑中的细菌被全部或部分裂解。 噬菌体具有非 常专一的寄生性， 而且噬菌体的繁殖 必须依赖于寄主细 胞的繁殖，只能在 活的、正在繁殖阶 段的细胞中繁殖； 而在死的、衰老的 、处于休眠状态的 细胞中，或在代谢 产物或培养基上均 不能繁殖。 利用双层琼脂法形成噬菌斑 噬菌体的纯化和噬菌斑的形状 5.1.9 溶源性细菌与温和性噬菌体 烈性噬菌体 噬菌体侵入细菌细胞后，增殖很快， 在较短时间内使细菌裂解。一般称这种噬 菌体为烈性噬菌体。在谷氨酸发酵生产中 遇到的多数为烈性噬菌体。 溶源性细菌和溶源性检查 溶源性

12、细菌 有些细菌遭受噬菌体侵入后，并不立即裂 解死亡。噬菌体侵入细胞后和寄主的遗传物质 紧密结合一起，在没有再度感染的条件下，能 随着细胞的繁殖，在子代细菌中代代相传，不 断延续，这种细菌称为溶源性细菌。溶源性细 菌通常可以自发地释放噬菌体，每一代有10- 210-5细胞发生裂解，释放出具有感染能力的噬 菌体。 溶源性检查 溶源性检查 在琼脂平板培养基上涂布指示 菌，干燥后用接种环点2025个被检菌培养液， 经UV照射后培养，检查溶菌斑。 温和性噬菌体 产生噬菌体的潜在能力称作为溶源性，将 具有溶源性的细菌称作为溶源性细菌，它所产 生的噬菌体称温和性噬菌体，也称溶源性噬菌 体。温和性噬菌体形成的

13、噬菌斑是浑浊的，因 为中央有溶源性细胞生成。反之，某些突变所 形成的噬菌斑是清晰透明的。一般常规平板法 很难把温和性噬菌体检查出来，只有在适当条 件下转化为烈性噬菌体才易查出。 5.1.10 谷氨酸发酵噬菌体的主要特性 具有非常专一的寄生性 谷氨酸产生菌噬菌体必须在专一的寄 主细胞中生长繁殖，不能脱离寄主而自行 生长繁殖，也不能在培养基上增殖，只有 在活的、处于繁殖阶段的寄主细胞中生长 繁殖。 不耐热 不同噬菌体对热稳定性是不同的，但 一般噬菌体都是不耐热的，会受热变性死 亡。一般谷氨酸产生菌在6065下 10min全部致死，其噬菌体在 70510min全部致死。 对pH 的稳定性 在pH7.

14、09.0时稳定，在pH6.0以下和 pH10.0以上时不稳定，容易失活，小于 pH4.0时，完全失活。 嗜氧性 在低溶氧的条件下，其活性被抑制。 干燥条件下的稳定性 在非常干燥的状态下，5个月以上仍然 稳定。噬菌体在干燥状态（相对湿度10%、 30）比在湿润状态（相对湿度90%、30 ）稳定。 不耐药性 对药物很敏感，0.5%甲醛、0.5%苯酚 、1.5%漂白粉、1%石灰、1%双氧水、 0.5%高锰酸钾、1%新洁而灭，都可使谷氨 酸产生菌噬菌体失活。 传播性 由于噬菌体极小，质量很轻，存活期 长，所以地面上一旦存在噬菌体，则在一 定范围的空气中必有噬菌体，空气流动使 噬菌体得以传播。 在UV照

15、射下失活 在液层5mm，距UV-15W灯15cm，照 射2min，噬菌体完全失活。 5.1.11 噬菌体的感染途径和感染规律 噬菌体在自然界中分布很广，在土壤 、污水、腐烂的有机物和大气中均有存在 ，凡是有寄主细胞的地方一般都存有它们 的噬菌体，发酵车间、提取车间及周围更 有机会积累噬菌体。造成噬菌体污染必须 具备三个条件：有噬菌体；有活菌体 ；有使噬菌体与活菌体接触的机会和适 宜条件。 感染噬菌体的最初发源点：一是菌株携带 噬菌体或菌株本身就是溶源性菌株。生产上使 用的原始菌株本来就是由自然界筛选得到的， 由于一部分溶源性细胞诱发成温和噬菌体，再 经过变异就有可能成为烈性噬菌体，导致使用 菌

16、株感染，引起危害。更主要的原因是把活菌 体排放到环境中，使生产环境中存在的噬菌体 有寄主而不断增殖，结果使环境中噬菌体的密 度增高而形成污染源。此外，活菌体与其有关 的其它溶源性菌株接触，经过变异、杂交，最 终发生使生产菌株溶菌成烈性噬菌体，逐渐增 殖，污染环境。 一般来说，当环境中噬菌体浓度达到 102103PFU/mL，种子罐的噬菌体浓度达 到104PFU/mL，主发酵罐的噬菌体浓度可 达到106107 PFU/mL；严重溶菌时，其 浓度甚至可达1010PFU/mL以上。 5.1.12 谷氨酸发酵感染噬菌体时出现的主要症状 发酵液光密度（OD）在初期不上升或回降 pH逐渐上升且不再下降 耗糖缓慢或停止，周期延长，提取困难 产生大量泡沫、发酵液粘度大、发红、发 灰 谷氨酸产量甚少，或者增长极为缓慢 镜检革兰氏染色呈红色碎片，找不到完整细 胞 平板检查有噬菌斑 菌种对营养要求增大，但培养时间仍然延长 发酵后期感