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1、张晓辉 10808040 生物去污：通过途径工程净化环境 途径工程(Pathway Engineering) o 途径工程(Pathway engineering)，被称 为第三代基因工程，改变代谢流向，开辟新 的代谢途径是途径工程的主要目的。 o 途径工程是一门利用分子生物学原理系统分 析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理 设计细胞代谢途径及进行遗传修饰，进而完 成细胞特性改造的应用性学科。途径工程在 分析代谢途径的基础上，定性地改变细胞内 代谢流走向，调整原有代谢网络，进而提高 特定代谢物的产量。外源基因的准确导入及 其编码蛋白的稳定表达，可以拓展细胞内现 有代谢途径的延伸路线，以获得
2、新的生物活 性物质或者优良的遗传特征。 o 生物去污的优点： 1）条件温和； 2）成本低； 3）有一定的专一性和可选择性； 4）比较彻底，几乎无二次污染； 5）可以解决传统方法无法解决的污染； 。 o 许多微生物天生就具有这种降解、转化，或 者螯合各种毒性化学药物的能力，但效率都 比较低。所以有必要通过途径工程对这些微 生物进行操作或改造，提高其去污的能力， 进而实现去污的目的。 Pathway engineering for enhanced bioremediation Inorganic pollutant removal 1、一些重金属污染的生物去除 o 当遇到重金属时，大多数微生物都
3、会做出反 应产生金属鳌合肽 ，比如植物螯合肽（PCs ）和金属硫蛋白（MTs） 植物螯合素的化学结构示意图 金属硫蛋白（MT）生命蛋 o 在大肠杆菌里使负责PC合成的拟南芥植物 螯合肽合成酶（AtPCS）过表达，使金属堆 积提高到20倍。 o 类似成就还有在共生根瘤菌细菌中。 o 但合成PC的前体物质谷胱甘肽（GSH）的 限制成了重金属的堆积的瓶颈。 o 解决方法： 1）共表达负责产生GSH的酶，结果PC的 合成增加了10倍 ； 2）通过在能够提供足够的GSH的啤酒酵 母中表达PC合酶 。 o 另外，MTs和PCs的一个特点是非选择性结 合各种重金属。 o 解决方法： 1）改造特定重金属的转运
4、体 2）提高吸收的能力 3) 利用在特定的金属污染场所自然突变 的金属结合MTs o 金属调节蛋白在去除重金属污染中也发挥着 重要的作用，通过设计提高其高亲和性和自 然选择性，并应用到汞和砷的特异聚集中。 2、放射性污染的生物去除 o 自然存在的高耐受放射的细菌是提高放射 性污染净化的理想代谢设计候选对象 。 o Brim等第一次报道使用极端放射耐受和嗜热 细菌Deinococcus geothemalis通过编码表 达大肠杆菌里的mer操纵子实现对Hg2+的还 原。这种工程菌能够在较高温度和电离辐射 下还原汞。而其还能还原Fe()，U()和 Cr()。 o 在P. aeruginosa中通过
5、多聚磷酸激酶和外 切聚磷酸酶的过表达，聚磷酸酯也能使放射 物以金属磷酸盐的形式凝结 o 最近一种非特异磷酸酯酶phoN在放射耐受 性细菌D. radiodurans中获得表达，使铀 从稀释的核废料中生物凝结 。 o 定向诱导也被用来改善铬酸盐和铀酰还原酶 的酶效率。 Engineered microbes for organic chemical removal 有机化合物的去除之改造微生物 磷酸二乙硝苯酯磷酸二乙硝苯酯 硝苯硫酸酯硝苯硫酸酯 甲基硝苯硫酸酯甲基硝苯硫酸酯 二苯酰硫胺素二苯酰硫胺素 1、有机磷酸盐（OPs）的生物去除 o 有机磷酸酯水解酶（OPH）具有降解Ops的 能力。OPH
6、能够催化P-O键的水解，释放p- 硝基酚基团。 o 因为磷酸酯的水解可以显著地减少Ops的毒 性，许多研究人员就把注意力集中到了OPH 的最初水解上。 o 可以应用基因工程技术如DNA同源重组技术 ，定向诱导，或者错位PCR技术来提高OPH 的催化活性和底物专一性。 o 运用DNA同源重组技术分别获得了甲基硝苯 硫酸酯（杀虫剂）和氯螨硫磷（杀虫剂）的 25倍和725倍的高水解效率的突变体。 o 另外，运用细胞表面酶的易位，并通过解除 Ops通过细胞膜的转换瓶颈增强生物解毒的 效率。 o 运用Lpp(lipoprotein脂蛋白)OmpA (outer membrane protein A外膜蛋
7、白A) 系统将OPH释放到大肠杆菌表面，使硝苯硫 酸酯的降解比OPH在细胞内表达要快7倍。 目前，探索OPH分泌到细胞膜间隙的工作也 已开展，以全面提高其水解效率。 o 尽管一些Ops能够初始水解转化成一些低毒 的p-硝基苯(PNP)和二烃基磷酸盐，但这些 降解产物依然含有毒性，抵抗生物降解。 o 一种能够水解硝苯硫酸酯和二乙基硫代硫酸 酯的改造的大肠杆菌和具有天然降解PNP的 Pseudomonas putida恶臭假单胞菌结合 培养能够顺利分解硝苯硫磷酯，且没有PNP 的积累。 o 改造的Moraxella sp摩拉克式菌属或者P. putida（Pseudomonas putida恶臭假
8、单 胞菌）也能自然地降低PNP。在前者中， OPH在细胞表面被表达，并证明能够同时降 解硝苯硫磷酯，甲基硝苯硫磷酯和二乙硝苯 磷酸酯，且它们的水解产物都是PNP。在后 者中，运用了一个P. putida菌株，其包含 一个固有的PNP降解操纵子。 o 在P. putida菌株中引入一个表达OPH，磷 酸二酯酶（Pde）和碱性磷酸酶（PhoA） 的合成操纵子能够水解Ops和矿化二乙基磷 酸盐，分别在24小时，78小时和142小时 能完全降解二乙硝苯磷酸酯，PNP和DEP。 2、有机硫化合物的生物去除 o 有机硫化合物中二苯酰硫胺素（DBT）是最 多的一种分子 o 传统的加氢脱硫工艺，不能满足需求，
9、也不 能有效地将DBT从矿质燃料中去除 。 o 最近在脱硫作用的研究主要关注在运用微生 物的生物改造方面 。 o DBT的生物脱硫作用需要一系列的酶 限速步骤 o 可以通过改造DszB基因5非编码区获得 DszB的高表达。这种合成的突变体的脱硫 作用效率相对DszB在细胞自然表达提高了9 倍。 o Li等报道了另一项关于DszB改良的研究。正常的 dsz 操纵子表现特征显示dszA, dszB和 dszC的 mRNA比率是11:3.3:1，但是DszB的酶水平最低 。这是由于DszA的终止密码子和DszB的起始密码 子交错重叠所致。为了获得稳定的DszB的表达， 插入含有可能的核糖体结合位点的
10、序列对这种酶进 行重新设计，结果，改造操纵子的细胞的表达是没 改造操纵子的5倍高，整个脱硫的活性提高了12倍 。 3、硝基芳香族化合物的生物去除 o Nitroaromatic（硝基芳香族）化合物如硝 基苯和硝基甲苯 o 大部分微生物通过氧化还原酶使 Nitroaromatic化合物转化成胺。 o 酶活性的合理设计已经被用来提高 nitroaromatic化合物的降解。 o 1,2-dioxygenase（1，2-双加氧酶）,它能 催化硝基苯转化成邻苯二酚和亚硝酸盐。对 这种酶活性位点附近部分293 (F293Q)进行 氨基酸取代扩展了酶的底物专一性，结果对2 ，6二硝基甲苯的氧化作用速率快了
11、2.5倍。 o 同样的方法还用在2-硝基甲苯双加氧酶，这 种酶负责氧化硝基甲苯成3-甲基邻苯二酚和 亚硝酸盐。活性位点258 (N258V)附近区 域选择性定向诱变和取代很显著地改变底物 专一性。 o 2，4-二硝基甲苯双加氧酶(DNTDO)是另 外一种酶，分解代谢2，4-二硝基甲苯成4- 甲基-5-硝基邻苯二酚和亚硝酸盐。对 DNTDO的 I204位置进行突变扩大了其底 物特异性。通过饱和诱变，获得了针对二硝 基甲苯(DNTs) 如 2,3-DNT, 2,5-DNT, 2,6-DNT,2NT和4NT的显著的改良。 o DNT降解的起始产物4-甲基-5-硝基邻苯二酚 ，通过MNC双加氧酶（如图
12、）的作用转变成 2-羟基-5-甲基苯醌。MNC双加氧酶具有较 窄的底物特异性，只能结合MNC和4-硝基邻 苯二酚。通过设计得到(M22L/L380I)两个 区域的突变体，结果能够转化4-硝基邻苯二 酚和3-甲基-4-硝基邻苯二酚，对4-硝基邻苯 二酚的降解效率比野生型酶高出11倍。 o 基因组重排技术也被用来探索另外一种重要 的杀虫剂五氯苯酚（PCP）的生物降解。其 中，获得的一些突变菌株能够完全降解PCP 。 o 另外，全面的基因组技术像全功能基因组学 ，生理学分析和模型建立能够获得增强型微 生物，在多重水平上拥有最优的生物降解途 径能力。 o 目前。寻找新的有毒化学物的降解酶及其降 解途径
13、非常热门，炸药降解P450系统在降 解高毒性炸药hexa-hydro-1,3,5-trinitro- 1,3,5-triazine(RDX)中显示出了其特征性 。新发现的XplA和XplB，在Arabidopsis 中高表达时，使得RDX快速地被移除。 o 另外一种感兴趣的方法是从 Sphingomonas sp. A1中开发专一性的膜 结构“高通道”，增强污染物的吸收。在S. wittichii RW1降解二噁英和在S. subarctica IFO 16058T降解聚丙烯乙二 醇中这些高通道的引入导致生物去污能力实 质性增强。 Conclusion o 各种分子，基因和代谢工程方法的研究加速 了生物去污的发展，产生各种用于生物净化 进程的专一性设计的微生物。基于生物去污 途径，关键酶的结构及功能知识，以及自然 解毒微生物多方面分子鉴定等知识库的扩展 将会进一步促进设计一种新的生物去污方法 的进程。 知识回顾知识回顾 Knowledge Knowledge ReviewReview
