质粒酶切鉴定讲解

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1、分子亚克隆 PCR 酶切 连接 转化 挑克隆 提质粒 酶切鉴定 测序 目的基因的获得及克隆 实验一 质粒的制备 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表 达的主要载体，它在基因操作中具有重要 作用。质粒的分离与提取是最常用、最基 本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括3个主要 步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、 质粒DNA的分离和纯化。 实验原理 在pH 12.0 12.6碱性环境中，细菌的线性大分 子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒 DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调 至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分 染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂 SDS的作用

2、下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶 状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染 色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中 ，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别 为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型 吸光值检测：采用分光光度计检测260nm 、280nm波长吸光值，若吸光值 260nm/280nm的比值介于1.71.9之间， 说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8 说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污 染。 实验步骤： 取含有质粒的大肠杆菌菌液于LB培养基上37过夜培养； 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37摇

3、床250 r/min过夜培养； 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液 ，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净； 加入300 ul溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉 淀或碎块）； 加入300 ul溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟； 加入300 ul溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀； 12000 g离心10分钟； 吸取800 ul上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中， 加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟； 12000 g 常温离心15分钟； 倒尽上清，

4、加75乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）； 室温放置或超净台上风干DNA； 加40 l灭菌超纯水或TE溶解； 质粒质量检测，于-20保存。 实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电 泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已 成为分子生物学技术中分离生物大分子的 重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简 单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴 定核酸的常用方法。 实验原理 在pH值为8.08.3时，核酸分子碱基几乎不解离 ，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时 向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电 泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和 构象不同的核酸分子泳

5、动率出现较大的差异， 从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核 酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯 下可观察到核酸片段所在的位置。凝胶上所加 电压不应超过5V/cm 。 实验步骤 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上； 调整好梳子的高度； 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒 完全溶解，冷却至45-50C时倒入制胶板中； 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带； 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中； vector5l + ddH2O 4l + 10溴酚蓝1l 共10l于0.5ml tube中混 合后点样； 将制胶板放入电

6、泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向 正极泳动； 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 g/ml的溴化乙锭（EB ）溶液中染色1015 min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳 结果，并照相记录。 实验三 外源DNA片段在质粒载体中的克隆 DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的 酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的 片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛 选和鉴定等内容。 实验原理 限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA 产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA 的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载 体多克隆位点上相应的限制性内切酶切割 ，并进行回收；在连接酶的作用下将外源 片段连

7、接到载体上，实现外源片段的克隆 。 克隆中用到的几种工具酶： （1）限制性内切酶 限制性内切酶的一个活性单位（1U）：指在15 ul反应体系 中，37下，经过1小时的反应将1ug DNA完全切割所需要 的酶量。 限制性内切酶的star活性：限制酶在某些条件下使用时对 DNA切割的位点特异性可能降低，即可以切割与原来识别的 特定DNA序列不同的碱基序列，这种现象叫限制酶的star活 性。它的出现与限制酶、底物DNA以及反应条件有关。 （2）连接酶 体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶 和T4噬菌体连接酶，但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶 都是首选的酶，因其能在正常的反应条件下能有效的将平端 连接起来。 实验步骤 载体和外源DNA片段的限制性酶切： （10ul反应体系，用1.5ml tube，冰上操作）： DNA5ul R.E 1ul 10buffer2ul ddH2O 2ul 连接反应（15 l体系）： DNA 10 ul PET 2.5 ul buffer 1.5 ul T4 ligase 1 ul 质粒的转化及转化子的鉴定 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建 的重组子导入细菌的过程。将连接产物转 化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖 ，便于后续分子操作。可以采用多种方法 筛选和鉴定目的克隆。