生物工程制药讲解

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1、第六章 生物工程制药 第一部分 生化制药技术应用 第二部分 生物工程分类生产工艺例讲 第一部分 生化制药技术应用 一、基本概念 二、提取法基本概念 三、提取方法的分类（略） 四、成品的灭菌方法 五、成品的干燥方法 六、现代生物技术在生化制药的应用 一、基本概念 1、生物化学药物，简称生化药物，是从动物、植物 、微生物等生物体提取分离所得的，用于预防、 治疗、诊断疾病的药物。 2、生物化学制药也称为“脏器制药，在本草纲目 中所收载的1892种药物中，就有动物药444种” 。 3、生物化学制药主要采用提取法。 生化药物的特点 是来自于生物体中天然存在的生化活性物质 为生物体中的基本生化成分，具有高

2、效、低毒、 量小的临床效果 化学结构和组成比较复杂，分子质量大，不易化 学合成 主要应用生化技术从动植物人的器官、组织和细 胞中分离纯化 二、提取法基本概念 1、提取 2、提取方法的分类 3、提取过程的三个阶段 4、影响提取的因素 5、溶剂的种类 1、提取 提取（ Extraction）也 称萃取、或者抽 提，是指利用一 种溶剂对不同物 质的不同的溶解 度，从混合物中 分离出一种或者 几种组分的过程 2、提取方法的分类 （1）按提取温度分为 冷溶剂提取-浸渍法（Maceration） 热溶剂提取-浸提法（Digestion） （2）按所提取的对象分为 针对固体材料的提取-液固提取 针对液体材料

3、的提取-液液提取 3、提取过程的三个阶段 （1）提取-被提 取物与溶剂紧密 接触 （2）分离-成份 的分离 （3）回收-溶剂 的回收 4、影响提取的因素（1） （1）所提取物的体积-溶剂的量为原料体积的1 -5倍。 （2）温度-温度升高有利于增加物质的溶解度 和溶解的速度。但是，针对不同的物质，提取温 度有不同的要求： 酶的提取需要在010度之间进行。 核酸的提取要求进行低温操作，以防生物大分子的 降解。 脂类药物的提取应该避免加热，以防脂类氧化。 4、影响提取的因素（2） （3）PH值 蛋白质的提取以酸性提取液为主，碱性条件会使 得蛋白变性而失活。 多糖类化合物以碱性提取条件较好。 （4）盐

4、浓度 低溶度的盐可以增加蛋白质的溶解度，称为盐解 作用或者盐溶作用。常用的盐溶液有0.15M的氯化 钠、0.02-0.05M的磷酸盐缓冲液、0.02-0.05M的 焦磷酸钠缓冲液。 在提取血液细胞成份时，用蒸馏水提取反而比盐 溶法更加有效，这是因为低渗能够破坏膜结构。 5、溶剂的种类（1） （1）酸溶液 （2）碱溶液 （3）盐溶液 （4）表面活性剂 脂肪酸盐（R-COONa） 高级醇硫酸酯盐（R-OSO3Na） 烷基苯磺酸盐（R-C6H4-SO3Na） 烷基氨基酸（R-NH-CH2-COOH） 长链季铵盐 吐温（Tween） 5、溶剂的种类（2） （5）有机溶剂 极性溶剂-甲醇、乙醇、丙酮、丁

5、醇、醋酸 乙酯 非极性溶剂-乙醚、氯仿、苯 常常用丙酮处理原材料和半成品，这是因为为了 脱水和脱脂，同时，做成丙酮粉便于保存，能 使细胞松散，有利于提取。从动物原料中提取 多肽时，也常常用不同浓度的丙酮作为提取溶 剂，因为在丙酮之中，多数蛋白质为不溶性， 这样可以减少杂蛋白质的溶出。 6、乳化作用和去乳化的方法 在进行液-液提取时，常常发生乳化作用 去乳化的方法有： （1）离心或过滤分离 （2）轻轻搅动 （3）改变两相之间的比例 （4）加热 （5）加电解质如氯化钠、氢氧化钠、盐酸 7、溶液与固体之间的分离方法 在进行液-固提取 时，溶液与固体 之间的分离有： （1）自然沉降 （2）过滤 （3）

6、离心 三、提取方法的分类 （一）盐析法 （二）有机溶剂分级沉淀法 （三）等电点沉淀法 （四）结晶和重结晶法 （五）酶解法 （六）萃取法 （七）透析法（见膜分离技术） （八）吸附法（见层析技术） （九）过滤技术 四：成品的灭菌方法 1、干热灭菌法 2、湿热灭菌法 3、紫外线灭菌法 4、过滤灭菌法 5、化学灭菌法 1、干热灭菌法 （1）火焰灭菌法-直接置火焰中灼烧15-20秒， 或者迅速通过火焰3-4次，可以杀灭微生物，此 法主要用于金属、玻璃、瓷制品的灭菌。 （2）干热空气灭菌法-利用干燥的热空气进行 灭菌，本方法适用于耐高热的操作器械的灭菌。 一般来说，干热空气灭菌法不适用于注射液的灭 菌。

7、细菌可在100、1小时被杀死。芽孢则需要160- 170、1小时（或者140、3小时）被杀死。 2、湿热灭菌法 （1）常压灭菌法-100流通蒸汽，或者在沸 水中通过煮沸进行灭菌。时间为3060分钟， 可杀死细菌、但不能杀死芽孢。 （2）低温间歇灭菌法-将物品在80加热1小 时，使得其中的细菌被杀死，芽孢则没有杀灭 。然后在20-25保持24小时，使芽孢发育 成细菌再80加热1小时，使得重新产生的 细菌又被杀死。这样连续重复3次以上，可 杀灭全部细菌。 2、湿热灭菌法 （3）热压灭菌法-热压灭菌法是最可靠的灭 菌方法，能够杀死所有细菌和芽孢。只要条件 允许，就应该使用这一方法，具体如下： 115

8、.5 1.7kg/cm2（表压0.7kg/cm2） 30 分钟 121.5 2.0kg/cm2（表压1.0kg/cm2） 20 分钟 126.5 2.4kg/cm2（表压1.4kg/cm2） 15 分钟 3、紫外线灭菌法 主要用于空气及物体表面的灭菌操作，由于紫外 线的穿透能力很弱，故不能用作玻璃容器内物品 的灭菌 4、过滤灭菌法 过滤灭菌法的分类： （1）硅藻土滤柱 （2）素瓷滤柱 （3）垂熔玻璃滤器（4）石棉板滤器 （5）纤维素酯膜过滤 （6）聚碳酸酯膜过滤 过滤灭菌法的应用： （1）由于较小活菌的直径约为0.5um，滤孔直径只有 在0.2um时才有效果。 （2）由于滤孔细小，对于滤液的通

9、过也产生了很大 阻力，为此，可以采用加压过滤、或者采用真空抽 滤的方法来进行助滤。 （3）过滤灭菌法适用于不耐热药物溶液的灭菌操作 ，并可以将活菌一起滤去。缺点是过滤的溶液在下 一道分装工序中容易再一次污染细菌。 4、过滤灭菌法 5、化学灭菌法 用于抑制细菌生长的药品称为抑菌剂。 用于杀灭细菌生长的药品称为杀菌剂。 用于无菌室空气灭菌： （1）甲醛蒸汽灭菌 （2）丙二醇蒸汽灭菌 （3）乳酸蒸汽灭菌 用于其它场所的杀菌剂： （1）苯酚 （2）煤酚皂 （3）乙醇 （4）B-丙内酯 五、成品的干燥方法 （一）烘干法 （二）真空干燥法 （三）冷冻干燥法 （一）烘干法 HZG型直接加 热式回转滚 筒干燥

10、机 高速离心 喷雾干 燥机 GFG型高 效沸腾 干燥机 振动流化床 干燥机 （二）真空干燥法 正负压两级干燥机 SZG系列双锥回转真空干 燥机 （三）冷冻干燥法 1、冷冻干燥法的定义 2、冷冻干燥法的优点 3、冷冻干燥的系统组成 4、冷冻干燥法的工艺 5、冷冻时使用的赋形剂 6、冷冻干燥物品的含水量控制 1、冷冻干燥法的定义 样品经过完全冻结，并 在一定的真空条件下 使其升华，从而达到 低温脱水的目的，这 种方法称为冷冻干燥 法。 对于一些不耐热的物质 ，如酶、激素、核酸 、血液制品、免疫制 品的干燥成为适宜。 冷冻干燥机 2、冷冻干燥法的优点 冻干的制品由于微小冰晶体的升华而呈现多孔结构 ，

11、并且能够保持原先冻结时的体积，加水之后极 易溶解，并能立即恢复原来的新鲜状态。 干燥的结果能够排出9599%的水分，有利于制品长 期保存。 3、冷冻干燥的系统组成 冷冻干燥机由以下系统组成： （1）真空系统 （2）加热系统 （3）电器仪表控制系统 冷冻干燥机主要部件有： （1）干燥箱 （2）凝结器 （3）冷冻机组 （4）真空泵组 （5）加热器 4、冷冻干燥法的工艺 包括三个阶段： （1）冻结 （2）升华 （3）再干燥 5、冷冻时使用的赋形剂 （1）乳糖-其特点是外观洁白均匀，但缺点 是引湿性较高。常用浓度为36%。 （2）甘露醇-其优点为引湿性很小，缺点是 外观颗粒较粗。常与乳糖配合使用，配合

12、比例 为1：1，赋形剂总浓度为36%。 （3）水解明胶-外观细腻、呈海绵状。对于 某些生物制品还具有稳定作用，缺点是容易吸 潮，常常与甘露醇配合使用。 （4）葡萄糖-8.5%可以减轻注射时的痛感， 用作赋形剂也要其独到之处。 6、冷冻干燥物品的含水量控制 由于冷冻干燥物品引湿性强，极易潮解，为此应 该注意以下问题： （1）冷冻干燥之后的物品应放入无菌干燥空气进 行再干燥，无菌干燥空气的制备方法是将空气 先经过浓硫酸溶液、高锰酸钾溶液、灭菌甘油 溶液洗涤，再通过灭菌变色硅胶脱水，进入干 燥箱。 （2）冻干成品在开箱时和温度要求比室温高，并 且应该在较短时间内熔封完毕。 六、现代生物技术在生化制药

13、的应用 （一）电泳技术 （二）层析技术 （三）膜分离技术 （四）固定化酶技术（略） （一）电泳技术 大分子的蛋白质、酶、核 酸、多糖、多肽、以及 小分子的氨基酸、核苷 酸等均可以用电泳法加 以分离和提纯。 丙种球蛋白、白蛋白、 ATP等-可以用醋酸 纤维膜电泳进行定量。 细胞色素C、胰岛素、糜 蛋白酶-可以用聚丙 烯酰胺凝胶电泳检查纯 度。 电泳技术种类 根据电泳材料分为： （1）纸电泳 （2）醋酸纤维膜电泳 （3）凝胶电泳-淀粉凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳 ，聚丙烯酰胺凝胶电泳。 （4）聚焦电泳-密度梯度电泳，等电点聚焦电泳 ，亲和电泳。 根据仪器设备分为： （1）园盘电泳 （2）板式电泳 1、

14、醋酸纤维膜电泳 醋酸纤维膜电泳已经 广泛应用于血清蛋 白质的分离、脂蛋 白质的分离、以及 各种生物制剂的纯 度检查。 如用醋酸纤维膜电泳 可以区别不同来源 的激肽释放酶。 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶是由单体-丙烯酰胺+交联剂-甲撑双丙烯酰胺 聚合而成的三维网状结构，具有分子筛效应，机械 性能良好，没有电渗作用和吸附作用。 优点： （1）蛋白质在电泳后的位置基本固定。 （2）凝胶的网状结构具有分子筛的效应，具有较高 的分辨率。如人的血清用纸电泳只能分出56个成 份，必用聚丙烯酰胺凝胶，则可分出1520个成份 。 凝胶的聚合反应需要有： （1）引发剂-过硫酸铵、核黄素。 （2）加速剂-TEMED

15、（N、N、N、N-四甲基乙二 胺），DMAPN（-二甲基氨基丙腈） 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为 （1）园盘电泳 （2）板层电泳 其中园盘电泳已经广泛应用于生物制剂的分离、纯 化和质量检验。 （1）用碱性凝胶体系分析猪胰岛素结晶，可以分离 出45个区带，其中A组分是大分子杂质，B组分是 胰岛素原以及类似物，C组分为胰岛素以及类似物 。 （2）猪胸腺素经过EDAE-C层析+SDS凝胶电泳，发现 是由89种蛋白质所组成，其分子量从9000 68000不等。 （3）用园盘电泳技术分析细胞色素C，发现其由4种 成份所组成，分别是C1、C2、C3、C4。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 3、等电聚

16、焦电泳技术 （1）等电聚焦的原理 （2）等电聚焦PH梯度的形成 （3）等电聚焦的优点 （4）等电聚焦的分类 （5）等电聚焦实例 （1）等电聚焦的原理 等电聚焦是指一个两性物质如蛋白质，在电场的作 用下，于PH梯度介质中泳动至各自等电点的PI区 域。 等电聚焦的原理-在等电聚焦柱中，按照两性载 体的不同等电点，由阳极向阴极建立逐渐升高的 稳定的PH梯度，在外加电场的作用下，样品被分 别聚焦于相当于各自等电点的PH位置而被分离。 （2）等电聚焦PH梯度的形成 两性载体（Carrier Ampholine）是由丙烯酸+多乙 烯多胺聚合而成，用于构成连续PH梯度。由于两 性载体的组成成份相当多，各成份之间的等电点 差别也相当小。 在外加电场作用下，两性载体各种成份按照与它相 异电荷的电极方向移动，最后停留在各自等电点 的