专题课题土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

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1、课题课题2 2 土壤中分解尿素的细土壤中分解尿素的细 菌的分离与计数菌的分离与计数 专题专题2 2 微生物的培养与应用微生物的培养与应用 一.研究思路 .筛选菌株： 实验室中微生物的筛选原理：人为提供有 利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 要分离一种微生物，必须根据该微生物的 特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选 择培养分离的方法，或抑制使大多数微生物不 能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过 一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升， 再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。 .统计菌落数目： 1.直接计数法：这种方法是利用特定细菌计数板或

2、 血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微 生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。 每毫升原液所含细菌数每毫升原液所含细菌数 每小格平均细菌数每小格平均细菌数4001000040010000稀释倍数稀释倍数 2.2.间接计数法间接计数法( (活菌计数法活菌计数法) )： 原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培在稀释度足够高时，微生物在固体培 养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖 而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 常用方法：常用方法：稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。 注意事项注意事项 每

3、克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M 其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平 均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液 的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。 注意事项注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030 300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。 为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三 个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出 菌落平均数。

4、菌落平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是这是 因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察 到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌 落数而不是活菌数来表示。落数而不是活菌数来表示。 涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要， 一般以三个稀释度中的第二个稀释度倒平板所一般以三个稀释度中的第二个稀释度倒平板所 出现的平均菌落数在出现的平均菌落数在5050个左右为最好。个左右为最好。 除上述两种常用的计数方法外，还有膜过 滤法、比浊法。膜过滤法

5、是当样品中菌数很低 时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等 样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色， 并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上(或 一定面积中)的细菌数；比浊法原理是在一定范 围内，菌的悬液中细胞浓度与混浊度成正比， 即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。因 此可以借助于分光光度计，在一定波长下，测 定菌悬液的光密度，以光密度表示菌量。实验 测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的 线性范围内，否则不准确。微生物计数法，发 展迅速，现有多种多样的快速、简易、自动化 的仪器和装置等方法。 . .设置对照：设置对照： 对照实验是指除了被测试条件以外，其他条件对照实验是指除了被测试条

6、件以外，其他条件 都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任 何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试和何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试和 条件引起相应的结果。条件引起相应的结果。设置对照的主要目的是设置对照的主要目的是 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，排除实验组中非测试因素对实验结果的影响， 提高实验结果的可信度。提高实验结果的可信度。 P22旁栏思考题 想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中 的菌落数？ 答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统 计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本 旁栏的公式进行计算。 P23讨论问题

7、 A同学的结果与其他同学不同，可能的解 释有两种。一是由于土样不同，二是由于培 养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可 以通过实验来证明。实验方案有两种。一种 方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样 进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A 无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作 失误或培养基的配制有问题。另一种方案是 将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进 行培养，作为空白对照，以证明培养基是否 受到污染。通过这个事例可以看出，实验结 果要有说服力，对照的设置是必不可少的。 二.实验的具体操作 .土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土 3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好

8、的信 封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用 前都要灭菌。 .制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。 . .样品的稀释：样品的稀释： 应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL 无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 。 分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不 同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落 数在30300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为104 、105、106，放线菌稀释度为103、104、105，真菌稀释 度为102、103、104。 P24旁栏思考题： 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀 释度？

9、测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能 分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同 吗？ 答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位 ：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上 层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万 ，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。 因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不 同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地 提供选择培养的条件。 . .取样涂布取样涂布 实验时 要对培养 皿作好标 记。注明 培养基类 型、培养 时间、稀 释度、培 养物等。 如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300 30300的的 平板，则说明稀释操

10、作比较成功，并能够进行菌落的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的 计数，如果计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较 大，表明试验不精确大，表明试验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。 . .微生物的培养与观察微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目 。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防 止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应 当事先规划时间。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌一般在3037培养12d，放线菌一般在 2528培养57d，霉菌一般在2528的温 度下培养

11、34d。 思考与讨论 在微生物培养过程中，为什么每隔24h统计一 次菌落数目？菌种鉴定的依据是什么？ 答：不同种类的微生物，往往需不同的培养温 度和培养时间，每隔24h统计1次菌落数目，选 取菌落数目稳定时记录作为结果，这样可以防 止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。不 同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光 泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的 特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。 三三. .结果分析与评价结果分析与评价 1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染， 菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则 菌落形态

12、多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出 分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。 2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300 个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合 适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不 能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精 确。确。 四四. .课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加在以尿素为唯一氮源的培养基中加 入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果 PHPH升高，指示剂将变红

13、，说明该细菌能升高，指示剂将变红，说明该细菌能 够分解尿素够分解尿素。 测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水 用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝 培养培养 基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出，通过记述得出 水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。 1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ） A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的目的是（ ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要

14、的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状，与其他微生物加以区 别 3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素 实践训练实践训练 A C D 4.下列说法不正确的是（ ） A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚 合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、 M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因 素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大， 种类最多。 5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加 入（ ） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐 B C