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1、生物化学大实验 实验指导老师 张萍萍 房伟 袁璟 袁莉 2013-09 生化实验 n实验一： Sephadex-G50层析法分离蓝葡聚糖- 2000和重铬酸钾 n实验二：植物基因组DNA的提取及分离纯化 n实验三：植物基因组DNA的鉴定与分析 n实验四：蛋白质的FPLC分离与定量测定 n实验五：SDS-PAGE测定蛋白质分子量 n实验六：聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋 白质的等电点 分子生物学实验 n实验七：质粒的小量抽提 n实验八：质粒DNA的酶切及电泳鉴定 n实验九：聚合酶链式反应技术 n实验十： PCR产物的胶回收纯化 n实验十一：大肠杆菌感受态细胞的制备 及质粒DNA的转化 n实验十
2、二：DNA的体外重组 实验要求 （1）实验前要预习相关的内容，弄懂原理，了解实验的设计思路，找出实验 操作的关键步骤，试剂的配制方法及用量，数据处理的方法等。 （2）实验过程中，要认真，规范的操作。学会安排实验时间和实验顺序。如 实记录实验中出现的现象和数据。 （3）使用仪器时要按照说明书去做。发现故障应停止使用。节约试剂。公用 试剂用完后，要及时放回原处。 （4）实验报告要及时完成。报告上要注明实验日期及温度。在报告的结果讨 中，对实验现象，结果和数据等可进行分析；也可对实验中遇到的问题及 实验中需要改进的地方进行讨论。 （5）一般试剂都应用蒸馏水或无离子水(即离子交换水)配制，有特殊要求的
3、 除外。 （6）试剂(特别是液体)一经取出，不得放回原瓶，以免因量器或药勺不清洁 而沾污整瓶试剂。取固体试剂时，必须使用洁净干燥的药勺。 （7）使用易燃、易爆、有腐蚀性甚至有毒的化学药品时应注意安全，必要时 应戴手套，带口罩或防毒面罩，并在通风橱中进行。 （8）实验纪律：不迟到和缺席。实验室的卫生要轮流值日。 成绩评定 n平时成绩：考勤 实验技能测试和实验报 告等 50 60% n期末理论考试： 50 40% l实验室： 207室 209室 l领用仪器： 211室 袁莉 实验 葡聚糖凝胶层析法 分离蛋白质 张萍萍 一. 目的和要求 n1. 掌握葡聚糖凝胶柱层析法的分离原 理及基本操作技术: 装
4、柱 平衡 加样 洗脱收集等步骤. n2. 了解Vt Ve Vo Vi Kd Kav等参数 的含义. 二.原理 n凝胶层层析（gel chromatography）又称为为凝 胶过滤过滤 （gel filtration）、分子筛过滤筛过滤 （ molecular sieve filtration） 等。它是20 世纪纪60年代发发展起来的一种层层析技术术。其基 本原理是利用被分离物质质分子大小不同及固定 相（凝胶）具有分子筛筛的特点，将被分离物质质 各成分按分子大小分开，达到分离的方法。 n凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结结构。网眼 里吸满满水后凝胶膨胀胀呈柔软软而富于弹弹性的半 固体状态态。人
5、工合成的凝胶网眼较较均匀地分布 在凝胶颗颗粒上有如筛筛眼，小于筛筛眼的分子将完 全渗入凝胶网眼，并随着流动动相的移动动沿凝胶 网眼孔道移动动，从一个颗颗粒的网眼流出，又进进 入另一颗颗粒的网眼，如此连续连续 下去，直到流 过过整个凝胶柱为为止，因而流程长长、阻力大、流 速慢；大于筛筛眼的分子则则完全被筛筛眼排阻而不 能进进入凝胶网眼，只能随流动动相沿凝胶颗颗粒的 间间隙流动动，其流程短、阻力小、流速快，比小 分子先流出层层析柱；小分子最后流出。分子大 小介于两者之间间的分子，不完全渗入凝胶网眼 ，则则居中流出。这样这样 被分离物质质即被按分子 的大小分开。 分子筛效应的理论 nA小分子由于扩散
6、作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，大分子被排阻在凝胶颗粒 外面，在颗粒之间迅速通过； nB(1)蛋白质混合物上柱 (2)洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子 则被排阻在颗粒之外（3）小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开 (4)大小分子完全分开 (5)大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行 进中。 n本实验 利用凝胶柱：SephadexG-50柱层 析，以水为洗脱液，分离大分子的蓝葡 聚糖-2000 （分子量200万）和小分子 的重铬酸钾（分子量293）; 根据组分 的颜色深浅绘制洗脱曲线; 并利用洗脱 参数计算组分的分配系数。 交联葡聚糖凝胶（商品名为 Sephadex) n
7、这是由葡萄糖的多聚物与1氯 2、3环 氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇 基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来， 凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和 环氧丙烷的比例（交联度）来控制。 交联葡聚糖凝胶（商品名为 Sephadex) n常以G10至G200号码标记 G： 反应凝胶的交联程度、膨胀程度等 G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。 如G25即表示吸水量为2.5ml/1g干胶。 市售有G10、G25、G50、G75、G100、G150、G200等型号。 G75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。 G75以下的称为硬胶。 n 一般说Sephadex G - l
8、015通常用于分离肽及“脱盐”。 Sephadex G75200用以分离各类蛋白质。 n 外水体积(Vo: outer volume) ： 指基质颗粒之间体积的总和. n 内水体积(vi:inner volume) ： 指基质颗粒内部体积的总和. n 基质体积(Vg) ： 指基质自身所具有的体积。 V。、Vi 和 Vg都是随着床体积和基质性质 变化而变化的。 n洗脱体积（Ve）：指自加样到组分出现最大浓度 （峰）时所流出的洗脱液体积。 n床体积Vt（total volume) ： 指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积 (Vt)。 Vt是基质的外水体积(Vo)和内水体积(Vi) 以 及自身体积(
9、Vg)的总和。 Vt = Vo + Vi + Vg = Vo + Vi Vt的测定: n Vt为柱床体积，可用下式计算： Vt=(D/2)2 h 式中，为常数3.14，D为柱直径，h为凝 胶床的高度。 n在实验中, 如何测定Vt? n Ve 与 Vo Vi 之间的关系为: nVe = Vo + Kd Vi 其中: Kd-样品组分在流动相和固定相之间的分 配系数. 也可视为 不同分子量组分在凝 胶颗粒内部和外部的分配系数. 它只与被 分离组分的分子量大小及凝胶颗粒孔径 大小和凝胶颗粒间空隙有关;与柱的长短 和粗细无关. Kd 可通过实验测定. 分配系数 Kd =（Ve Vo）/ Vi nKd 可
10、以有下列几种情况： n(1)当Kd=O时，则Ve=Vo，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子 物质(全排阻)，洗脱容积等于空隙容积(组分I)。 n(2)当Kd=1时，Ve=Vo+Vi，即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱 容积应为空隙容积与内容积之和(组分)。 n(3)当01时,Ve=Vo+KdVi,即表示组分不同大小可部分进入凝胶 颗粒内部(组分II) n1 有效分配系数Kav n已知 Kd=（Ve-Vo）/Vi，将Vt-Vo代替Vi， 则Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo） 即 Ve=Vo+Kav（Vt-Vo） nKav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联 度大的凝胶差别大。 n在一般情
11、况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当 流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出 来，这一点为凝胶层析法的特点 nVt = Vo + Vi+ Vg = Vo + Vi nKd =（Ve Vo）/ Vi n Ve = Vo + Kd Vi nKav = （ Ve Vo）/ （Vt Vo） n Ve = Vo + Kav（Vt-Vo） n层析柱（120cm）；梯度混合仪；恒流 泵；部分收集器；连接管等 n葡聚糖G-50（ SephadexG-50 ） n样品：蓝葡聚糖-2000、重铬酸钾混合液 （各1mg/ml） n洗脱液：纯水 三器材和试剂 1.装柱 n装柱是最关键键的一步。 n重力沉降法装柱
12、n陆续陆续 不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有 胶粒连续连续 均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适当 的柱床体积为积为 止。 n柱的表面始终终要保持着一层层溶剂剂(一般l3cm柱高) 柱的任何一部分绝对绝对 不能“流干”。 四. 操作方法 n层析柱的形状，一般直径 与高度的比为l：15为宜。 n柱形必须根据层析介质和 分离目的而定。待分离物 质的性质相近，柱越细长， 则分离效果越好，但流速 较慢。在样品组分并不复 杂的情况下，采用“矮胖柱”. 要求:垂直 柱面平 无气泡 无节痕 松散 均匀 n灌注凝胶时时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱 床高度，不能时时断时续时续 ，否则则将出现现分层层或“
13、 纹纹路”等毛病。若在灌好胶后才发现发现 “纹纹路”、 分层层等现现象时时，要重新装柱，以免影响层层析 效果。 n层层析柱正式使用前，必须须平衡至所需的pH和离子 强度，一般使用前用相当于柱床体积积2-3倍的洗脱 液流过过凝胶柱，以压实压实 凝胶，稳稳定柱床，称为为平 衡。 n检查检查 柱是否均匀，可用蓝蓝色葡聚糖2000，在恒压压 下走柱，如色带带均匀下降，说说明柱是均匀的，可 以使用，否则应则应 重新装柱. n在平衡期间间可调调流速. 2.平衡 3.加样样 要求:样样品体积积和浓浓度不变变(1.0ml) 有3种方法可将样样品加到已制备备好的柱顶顶： n1.简单简单 的方法是放除柱床表面以上
14、的溶液，但切忌液面低于凝胶表面。然 后将样样品加在凝胶表面，打开柱下口开关， 使样样品慢慢渗入凝胶内。加 样时样时 注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能沿管壁流下， 当慢慢渗入 凝胶的样样品液液面与凝胶柱面相平时时，关闭闭下口，完成上样样。然后在凝胶 柱面上加一层层（12cm柱高）洗脱液，接上洗脱瓶准备备洗脱。 n2.不需要让让柱流干至床表面，而是加入1浓浓度 的蔗糖来增加样样品的密度； n3.方法是用一个毛细细管和一个注射器或蠕动泵动泵 把样样品直接传传送到柱表面(如一些商品柱附有专专 门门加样样装置)。 n保持柱上端胶面平整、柱内无气泡和胶床不干 裂十分重要。为为此，除加样时样时 注意不破
15、坏胶面平 整外，在整个层层析过过程中，应应在胶面上端保留合 适体积积的洗脱液(约约1-2 cm柱高)，避免洗脱液滴 人柱内时时，破坏胶面的平整或可能造成胶床干裂 。 4. 洗脱 收集 打开层析柱下口开关，洗脱液即可流出进 行洗脱。按 1 ml/min收集洗脱液（加样 及开始收集）。每1分钟换1管，直到黄 色流完为止。 5检测检测 用+来表示颜色的深浅：+ + +等。 6. 绘绘制洗脱曲线线 以洗脱体积为或洗脱管为横坐标，纵坐标为颜 色的深浅，绘制洗脱曲线。 n蓝葡聚糖凝胶-2000和重铬酸钾的洗脱体 积：Ve蓝和e重。 n柱外水体积o n柱内水体积i n蓝和重 n柱床体积（与测量法的结果相比较 ） 7. 计计算 梯度洗脱装置 n柱层析用梯度混合器 1贮液瓶 2活塞 3. 混合瓶 4搅拌子 5活塞 6电磁搅拌器 7.出口(接层析柱) n8. 思考题 利用凝胶柱层析分离混合样品时, 怎样才能 得到较好的分离效果?
