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1、广西医科大学 硕士学位论文 腺苷A2A受体激动剂经P38MAPK途径对冠状动脉微栓塞致心肌损 伤的保护作用 姓名：曲楠 申请学位级别：硕士 专业：内科学（心血管） 指导教师：李浪 20090501 腺苷A 2 A 受体激动剂经P 38 M A P K 途径对 冠状动脉微栓塞致心肌损伤的保护作用 摘要 目的探讨腺苷A 2 A 受体激动剂C G S 21 6 8 0 对大鼠冠状动脉微栓 塞致心肌损伤的保护作用及其机制。 方法夹闭升主动脉，经左心室注射4 2 u m 的微球，建立大鼠冠 状动脉微栓塞模型，按观察时间分别于微栓塞后0 h ，1 h ，3 h ，6 h ，9 h ， 1 2 h 处死大鼠
2、，取心肌组织( 每组1 0 例) ，用W e s t e r nB l o t 方法确 定P 3 8 M A P K ( P 3 8m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s ，P 3 8 促分裂素 原活化蛋白激酶) 的清| 生高峰时间。再次建立冠状动脉微栓塞模型， 随机分为安慰剂组( P 组) ，P 3 8 M A P K 抑制剂S B 2 0 3 5 8 0 组( S 组) ， 腺苷A 2 A 受体激动剂C G S 2 0 3 5 8 0 组( C 组) 及腺苷A 2 A 受体激动剂 C G S 2 1 6 8 0 +
3、 P 3 8 M A P K 激动剂P 7 9 3 5 0 组( C P 组) ，每组1 0 例。分 别在微栓塞前于鼠尾静脉注射生理盐水、0 2 u g k gS B 2 0 3 5 8 0 、 0 2 u g k gC G S 2 1 6 8 0 、0 2 u g k gC G S 2 1 6 8 0 + 0 2 u g k gP 7 9 3 5 0 ，在微 栓塞后原测定的P 3 8 M A P K 活性高峰时间，用超声心动图测定左室射 血分数L V E F ，然后处死大鼠，取心肌组织，用W e s t e r nB l o t 法测定 心肌组织P 3 8 M A P K 活性，用免疫组化法
4、对磷酸化P 3 8 M A P K 在心肌 组织表达进行定位分析，用R T P C R 法测定心肌组织T N F 仅m R N A 的 表达。 结果经W e s t e r nB l o t 法测定P P 3 8M A P K 活性，在C M E 后各时 间点的动态变化，可见总P 3 8M A P K ( t o t a l P 3 8 M A P K ) 无明显变化， 而磷酸化的P 3 8M A P K ( p P 3 8 M A P K ) 在1 h 开始升高( 与O h 相比， P 0 0 5 ) ，至3 h 时达到高峰( 与O h 相比P 0 0 5 ) ， 遂定于微栓塞后3 h 为干
5、预的观察时间点，经各干预组干预后，微栓 塞后3 h ，S 组的P 3 8 M A P K 活性及T N F 仅m R N A 表达显著低于P 组 ( P O 0 5 ) ，如表1 及图1 。 表1 各干预组C M E 后心功能的动态变化 注：与P 组相比P 0 0 5 024 T 州岳) 81 0 图1 各组冠状动脉微栓塞后心功能的动态变化 注与P 组相比木P 0 0 5 钙 豁 踟 乃 为 酪 琴一皿锄一 2 心肌P 3 8 M A P K 活性的测定 经W e s t e r nB l o t 法测定P P 3 8M A P K 及t - P 3 8M A P K 光密度，用 公式p -
6、P 3 8 M A P K t - P 3 8M A P K 计算磷酸化P 3 8 M A P K 的光密度比值 确定P 3 8 M A P K 活性。C M B 后T o t a lP 3 8M A P K 无明显变化但 p - P 3 8 M A P K 灰度比存在动态变化，o h 、1 h 、3 h 、6 h 、g h 、1 2 h p - P 3 8 M A P K 的光密度比值分别为02 0 0 0 2 ，03 4 00 6 ，1 , 5 1 0 1 6 ， 11 7 0 1 2 ，0 8 4 0 0 8 ，02 4 0 0 7 ，可见p - P 3 8 M A P K 灰度比在1
7、h 开始升高，3 h 达到高峰( 显著高于0 h ，P 00 5 ) 如图2 。 一一p - P 3 8 M A P K T o t a lP 3 8 M A P K T i m e 【h o u r l 图2 A W e s t e n B l o t t i n g 检测C M E 后各时间点P 3 8 M A P K 活性 图2 B 各时问点心肌P 3 8M A P K 樯性变化半定量分析 注：与O h 组相比+ P ( 00 9 # P 00 5 根据C M E 后P 3 8M A P K 活性的最高峰3 h ，对此时间点进行干预 微栓塞前于鼠尾静脉注射生理盐水l m I 、0 2u
8、g k gC G S 2 1 6 8 0 、0 2 u g k g S B 2 0 3 5 8 0 、o 2u g k gC G S 2 1 6 8 0 + 02u g k gP 7 9 3 5 0 ，在 C M E 3 h 后，W e s t e r n B l o t 法测定p - P 3 B M A P K 与t - P 3 8 M A P K 比值。S 组p - P 3 8 M A P K 灰度比( 0 1 2 00 5 ) 显著低于P 组( 07 8 00 7 ) ( P O0 5 ) ，虽然活性较s 组略高，但无统计学差异( P O0 5 ) ； c P 组p - P 3 8 M
9、A P K 获度比( o 6 7 0 0 5 ) 显著高十s 组与c 组( P 00 5 ) 。如图3 T o t a l P 3 8 M A P K P 组S 纽 C 组C P 组 图3 A W e s t e r nB l o t j 1 0 定各干预组C M E 3 h 后p - P 3 8 M A P K 灰度比 ! | 善 一 r 3 心肌p - P 3 8M A P K 定位分析 3 1 组织学切片观察C M E 微栓塞球 经p - P 3 8M A P K 免疫组化及苏木素复染，可初步观察人鼠冠状动 脉微柃采心肌形态学上的基本变化，图4 可见2 个相同大小的微球， 微球周围组纵有
10、局部受压的现象。 j。rj： ：( o 、一- 。? 、 -、。- 、0 、 1 ”0 ：t 。一、? ，：i 。j ：“- V | 。 圈4 魁状动脉微栓塞后心肌盟 织中可见微球 4 0 0 倍 3 2p - P 3 8 在组织中的分布 显微镜下观察可见微栓塞K 域( 如图S ) j 远离微栓塞【划或( 如H6 】 的心肌细胞核为长梭形、呈褐色，均可见大堆p - P 3 8 M A P K 表达，而 正常心肌组织应为淡蓝色，少见染褐色心肌细胞核( 如图7 ) r ， 1 。 ， ， ， 。 j ，。 ，、- 一 j - ： j 。 ， j ， ， ，：j j t 一0 ， j ， 。一 。
11、图s 微球周围人量心肌细胞核表达p - P 3 8M A P K 【箭头所指为表达p - P 3 8 M A P K 的心肌细胞核4 0 0 倍】 。 1、 、。 、 - ，f 、 ： ”- ： 一 L k、 、 、 ，： Y 图6 微栓塞远离栓塞医心肌组织p - P 3 8M A P K 表达( t o o 信1 1 L 图7 正常心肌经p - P 3 8 M A P K 免疫组化、苏术素染色( 4 0 0 倍】 3 3 炎症细胞在组织中的分布 通过观察，我们发现在微栓塞心肌组织除可见染褐色呈长梭形的 心肌细胞核外，在其周外还发现白细胞细胞核，显著区别于周围的心 肌细胞核，其特点为：核圆大、
12、与周围长梭形心肌细胞易于区分、呈 淡蓝色，我们发现其细胞核未受p - P 3 8M A P K 免疫组化染色影响呈褐 色 如图8 。在小动脉周围也可以看到刚经内皮细胞和血管平滑肌细 胞游出向组织浸润的白细胞f 如图9 1 。 心：j 二一、一： 一。：一二一- ?o o S - ：、- 4 - ：二 二t ：- ：3 图9C M E 后远端血管内白细胞向周围组织漫润 I 粗箭头所 旨为微栓器远端的小动脉细箭头所指埘蔚卅的山细j j 乜t1 0 0 倍) 4 心肌组织的T N F - nm R N A 表达 经电泳及凝胶分析系统显示，T N F dm R N A 的R T P C R 扩增产物
13、片段为2 9 3 b p ，G A P D H 月段为1 5 0 b p 。根槲C M E 后P 3 8M A P K 活性 的最高峰3 h ，对此时间点进行干预将T N F - n 电泳条带的扫描密度 值1 1G A D P H 密度值得到T N F ：t U 对比。C M E 后3 h ，S 纽T N F n 灰 度比( 0 1 8 _ + 0 0 3 ) 缸著低于P 组( O 7 8 t 0 1 ) ( P O 0 5 0 0 O 0 0 O 0 0 0 讨论 1 冠状动脉微栓塞与无复流现象 P C I 是目前治疗各类冠心病尤其是急性冠状动脉综合征的重要手 段，P C I 能使狭窄冠状动
14、脉再通，有效改善缺血区域心肌组织的灌注。 然而在P C I 术后，尤其是急性心肌梗死的P C I 术后，部分患者与梗死 相关的冠状动脉虽能再通，但心肌组织却未能获得有效的灌注，此类 患者常伴有较高的死亡率和不良心血管事件发生率，这一现象的发生 其中一个重要原因就是P C I 术后“无复流现象”1 3 4 - 3 7 1 。P C I 术后冠状动 脉微血栓及斑块碎片堵塞远端微血管，即冠状动脉微栓塞，是无复流 现象发生的主要机制。已经有大量的研究表明，P C I 术后出现的无复 流现象会使患者随后的心血管事件的发生率和死亡率显著升高【3 8 瑚】。 冠状动脉微栓塞基本病理变化包括局部心肌的微梗死和
15、微血管 栓塞。目前已经有研究表明冠状动脉微栓塞后心功能与微梗死面积无 关【删，而实验性冠状动脉微栓塞后心外膜冠状动脉血流虽可恢复正常， 但冠脉储备及局部心肌收缩功能进行性下降【加，4 1 】。 2 P 3 8M A P K 在冠状动脉微栓塞致心肌损伤的重要作用 微栓塞后心肌收缩功能进行性下降向我们提出了一个问题：冠状 动脉微栓塞致心肌损伤及心功能下降最主要的原因是什么? 虽然目 前有研究证实T N F c 【在实验性C M E 损伤中扮演着重要的角色【1 ，2 3 ，2 4 ， 3 2 ，4 2 。倒，但是仍然有一些问题悬而未决：C M E 在刺激因子作用下通过 何种信号转导途径导致下游T N F 0 t 生成? 微栓塞损伤如何造成大量 心肌的收缩功能障碍? 本研究首先阐明了P 3 8M A P K 在冠状动脉微栓塞致心肌损伤的重 要作用。 2 7 P 3 8 M A P K 是一类对炎症介质和应激进行应答反应的细胞内磷酸 化蛋白质。细胞外的多种应激原，如紫外线、渗透压、放射线、炎性 细胞因子、生长因子、休克等均可将其激活，通过高度保守的三级激 酶“级联”程序来转导信号，当细胞受到刺激后，M A P K 激酶激酶 ( M A P K K K ) 首先被磷酸化而激活
