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1、<p>影响禾谷类花粉培养因素的综述【摘要】：禾谷类植物是我们日常生活中主要粮食，包括稻、麦、玉米、高粱、粟（谷子、小米）、黍、稷（糜子、黍子、粘糜子）、荞麦等。通过花粉培养的技术可以扩大禾谷类作物的种植，培育出新的优良品种，筛选优质作物。影响禾谷类花粉培养的因素较多，主要有花粉的游离、预处理、培养基的成分及培养条件等。关键词：禾谷类 花粉培养 游离花粉 预处理 培养基成分 自从Guha 和Maheshwari（1964）首次报道毛蔓陀(DaturametelL.）花药培养获得单倍体植株以来，花药培养已成为获得单倍体及纯合体的有效途径。花粉培养是在花药培养基的基础上发展起来的技术，它
2、无论对遗传基础理论的研究，还是对单细胞育种实践以及植物遗传工程都有重要意义。花粉培养区别于花药培养之处是：前者属于单细胞培养范畴，而后者属于器官培养范畴。植物花粉培养的主要目的，一是获得纯系育种材料和进行单倍体育种，以利用杂种优势，缩短育种年限和提高育种效率。二是用所获得的纯合二倍体材料进行植物遗传变异规律研究，使植物育种有坚实的遗传理论为依据，减少育种的盲目性。三是克服远缘杂种的不育性，获得具有双亲优良特性的可育远缘杂种。四是利用在远缘杂交F1 代的花药培养中出现的混倍体和丰富的染色体变异材料进行植物细胞遗传学等基础性研究。利用单倍体育种技术，进行作物改良，已在水稻、小麦等作物上取得了成功。
3、在我国，利用单倍体育种技术已育成了若干品种或品系。近年来我国杂交小麦等禾本科植物的研究进入了一个新的阶段,已开始从试验研究走向实际生产应用（陈生斗，2002）。影响花粉培养的因素主要有花粉的游离，花粉的发育时期，花粉的预处理，培养基的成分以及培养环境等。1 单倍体的获得与鉴定：人工诱发单倍体的发生中多采用离体培养花药或花粉。在花药离体培养过程中存在一系列的问题，如花药培养获得的新植株群体中倍性极其复杂，因为花药上的药壁、药隔等属于体细胞成分，二倍体的组织结构极易通过培养诱导出愈伤组织，由二倍体体细胞诱导出的愈伤组织与由有单倍体花粉组织诱导出的愈伤组织混杂在一起，因此在培养之前有必要获得游离的花
4、粉细胞。1.1 花药消毒在游离花粉之前需对花药进行消毒，以避免花药中所带的细菌、病毒在分离花粉过程中污染花粉。可将幼穗放入3%漂白粉精片溶液中表面消毒30 min，再用无菌水冲洗3次（王光远，1995）。也可在无菌条件下剥取幼穗，用75%酒精消毒30 s ，再用0.1% HgCl2 浸泡10-15 min ，最后用无菌水冲洗4-5次（张保兰，2002)。1.2 游离花粉的获得禾本科谷类作物在用挤压法获取花粉时较易被损伤，因此通常采用磁拌法和漂浮释放法获得游离花粉。磁拌法主要是将花药接种于盛有渗透压稳定剂的锥型瓶中，同时放入磁棒与几颗玻璃珠，在磁力搅拌仪上，低速旋转至花药呈透明，搅拌法可能导致花
5、粉受到不同程度的机械受伤，但可使花粉分离充分。而漂浮释放法则是将花药接种于液体培养基上，通过吸水膨胀作用，在2一4内天散出花粉，分离过程不损伤花粉细胞，但分离过程较缓慢且分离花粉欠充分。游离花粉后应将空花药壳移除培养基，避免花药壳与花粉一起被诱导成愈伤组织（刑小黑，1995）。1.3 花粉的选择与鉴定花粉培养时花粉的发育时期会影响愈伤组织和胚状体的形成，因此，花粉的培养时期应进行恰当的选择。花粉的发育时期分为单核期，此期液泡尚未形成；单核晚期，此期液泡形成；双核期，在此期已出现营养核及一生殖核；双核晚期，此期生殖细胞分列在花粉管内；三核期，生殖核一分为二，花粉尚未发芽（周维燕，2001)。在实
6、际操作中一般选取单核晚期的花粉进行接种（王光远等，1995；刑小黑，1995；孙月芳等，2003；张玉华等，1995；张保兰等，2002；李建安等，2002）。花粉发育时期的鉴定一般采用涂片法，接种前可用1% 醋酸洋红或花青络矾法进行染色（李建安等，2002，肖菁等，2010），压片后镜检，根据各期的特点确定花粉所处的发育时期。2 花粉的预处理花粉的预处理可以导致花粉细胞的某些基因发生改变从而引起花粉的内源激素与蛋白质产物不同，或是导致环境渗透压的改变从而使愈伤组织的产量提高（李文泽等，1995）。对于禾本科谷物可以采用的预处理方法主要有物理方法和化学方法，物理方法如-射线照射、高/低温预处理
7、、离心处理等。化学方法主要是使用乙烯利、糖类物质如甘露醇、生物碱如秋水仙素等（李文泽等，1995；张超美等，1995）。一般较常使用的预处理方法主要是低温处理和甘露醇处理。李文泽等人认为这些处理主要是使花粉细胞处于营养饥饿状态，促使营养DNA复制、分裂，使特定发育时期的花粉从生殖生长转向脱分化，促进愈伤组织产生。张超美等人认为，甘露醇处理主要是改变了环境中的渗透压，从而使愈伤组织产量提高。甘露醇的存在首先改变了体外的花粉细胞的生活条件，外周的水势比花粉细胞的水势低，促使花粉细胞失水，花粉细胞水势降低，细胞内的溶质颗粒不变但溶剂量降低，使渗透势降低，在细胞失水过程中伴随营养物质的消耗，因此，在甘
8、露醇处理中这两种原因应该都存在，只是它们作用的程度不同而已（潘瑞炽等，1989）。低温与甘露醇的处理这两种方法的作用对象一般有别，低温处理一般是作用于幼穗，且处理的时间较长，而甘露醇可直接作用于花粉或花药，作用时间大约在三天左右，使用的甘露醇浓度为0.3mol/l，PH为5.6能有效提高愈伤组织的质量（李文泽等，1995）。3 培养基成分及其影响3.1 培养基成分离体花粉萌发的需要有碳源、硼酸、矿质元素(如外源Ca2 + )及植物激素的参与(丁长奎等，1991)。适宜于花粉萌发及花粉管生长的培养基组分因植物的不同而异此外，花粉萌发和花粉管生长也需要一个较适宜的组分浓度，浓度过高或过低均不利于花
9、粉的萌发和生长。培养禾谷类花粉过程中通常用N6培养基，且改良的N6液体培养基，与固体培养基相比，花粉在液体培养基中分布更加的均匀，花粉周围生长环境一致(温婵等,2010)。当蔗糖浓度为155 g/L ，H3BO3浓度为20 mg/L 、CaCl2浓度为40 mg/L 、V-B1浓度5 mg/L 时，最适合水稻花粉萌发。在水稻花粉培养中，加入6%的蔗糖能促进花粉细胞的分裂生长（Cho M·S et al，1988），在玉米花粉培养中将蔗糖浓度调至8.0%9.5%可提高花粉愈伤组织形成率（Sntio T .et al，1989），用60 g/L 的麦芽糖为碳源可提高粳稻游离花粉的
10、萌发率（Xie J.H.er al，1994),在培养基中添加ABA可提高水稻愈伤组织的产率（TorrizoL.B et al，1986）。3.2 各种成分对花粉培养的影响3.2.1 蔗糖对花粉离体萌发的影响蔗糖是花粉粒萌发及花粉管壁合成的主要营养物质，是许多植物花粉离体培养所必需的重要营养成分(张绍铃等，2005)。它能为花粉萌发和花粉管的生长提供营养，并能维持外界环境一定的渗透压(杜玉虎等，2006)。花粉萌发和花粉管生长对培养基中糖类的浓度具有严格的要求，当外界糖浓度低于花粉内部的浓度时，花粉壁破裂，内容物析出，导致花粉生活力丧失。而蔗糖浓度高（例如高于20%）时，则会造成花粉的质壁分离
11、而抑制花粉萌发(周怀军等，2000)。只有在蔗糖浓度适宜（一般是155 g/L ）时，花粉内外的渗透压才能保持平衡，从而维持花粉正常的生活力，有利于花粉萌发(何琪等，2006)。3.2.2 硼酸对花粉离体萌发的影响硼酸能够增加花粉对糖的吸收、运转和代谢,形成糖-硼酸复合体,增加氧的吸收,并促进果胶物的合成(曾骧，1992)，从而促进花粉萌发和花粉管伸长。在自然条件下,花粉中硼的含量是不足的,这种不足通常由柱头和花柱内较高浓度的硼来进行补偿(年玉欣等，2005),而在离体条件下,适宜的硼处理能有效提高花粉的萌发率。适量的硼酸是花粉萌发和生长所必需的,一定浓度的硼酸有利于花粉萌发和花粉管的生长(符
12、碧等，2001)。3.2.3 外源钙对花粉离体萌发的影响一定浓度的钙是花粉萌发和生长必不可少的，在花粉的离体培养中, Ca2 + 影响细胞骨架的组装、分泌小泡的运输和融合、花粉管顶端的脉冲式生长(张绍铃等，2005)、花粉管生长方向调控等各个方面. 因此Ca2 +浓度的紊乱将会导致花粉管生长受到抑制或完全停止(黄静等，2004)。细胞内的游离钙离子是细胞感受刺激的第二信使,它的浓度可以影响外界环境刺激而迅速变化,进而引起钙离子下游的靶蛋白如CaM (钙调素) 、CDPK(CaM依赖的蛋白激酶)等活性的变化,调节细胞内许多生理生化反应,从而转导细胞感受的胞外刺激,以适应环境。3.2.4 激素对花
13、粉离体萌发的影响植物生长调节物质能改变植物体内源激素间相互平衡关系,对调节植物的生长发育,如花芽分化、性别决定、受精及坐果（丁之恩，1999；饶景萍等，1998；黄卫东等，1996）等有重要作用。花粉离体萌发中添加植物生长调节剂能促进花粉的萌发和花粉管的生长,但不同的激素种类和浓度对花粉的萌发和花粉管的生长影响不同，赤霉素能抑制植物体内生长素分解系统的活动，以保证体内生长素含量水平的相对增加，从而促进花粉萌发和花粉管生长。低浓度的赤霉素对花粉萌发和花粉管生长无影响，当浓度超过50 mg/L 时则起抑制作用。4 培养条件的选择禾谷类花粉对温度的反应非常敏感,培养温度23 之差就可能导致花粉愈伤组
14、织的产量大幅度甚至成倍提高或降低，也可导致花粉愈伤组织的质量发生明显变化。因此，选择一个合适的温度对于花粉的培养很关键。愈伤组织一般置于24-28 的暗环境中培养，而分化培养的条件根据各种植物的不同选择也应有所不同。小麦分化的培养条件为温度2025 ，光照强度1500 lx ,光照周期为16 h (肖菁等,2010)；大麦选择在25±1 、光强1800 lx、光照周期为12 h 的条件下培养（孙月芳等，2003)；水稻分化培养条件为温度2627 ，光照周期10 h ，光照强度为2000 lx（季彪俊等，1998）。除了温度、光照等因素外，一般还要考虑培养的密度。在花粉的培养过
15、程中需要选择一个合适的空间密度，使培养瓶内的空间及营养元素被充分利用，因为过高的培养密度易使花粉竞争氮源、营养元素及空间，不利于花粉的培养，因此，在接种时应根据培养瓶的体积、花粉的大小及培养基的体积控制花粉的密度，一般地，有效的培养密度范围为(5×103·2×104)·mL-1（秦余香等，2004）。5 花粉培养过程中存在的一些问题目前,利用花粉培养获得单倍体植株的研究已经取得了一些成就,但是在育种中采用花粉培养仍存在一些问题。花粉培养受到很多条件的限制，如花粉的基因型，花粉培养力的大小受多基因控制（陈兆贵等，1999），
16、不同基因型的花粉培养力存在很大差异。不同亚种的水稻如粳稻和籼稻因基因型不同，平均的愈伤组织产率不同，但两者的平均分化率差异不大，且在同一亚种中的不同品系也因基因型不同而出愈率不同（张林等, 2003），愈伤组织的产率决定了花粉培养力，出愈率低则花粉的培养率也相对降低；花粉颗粒小不易操作；除了花粉基因型和花粉颗粒小等内在因素外还有培养条件不易控制如碳源选择不当，在培养过程中代谢物质积累，pH值下降等；花粉获取时易受污染且不易去污。值得注意的是，在游离花粉培养中，雄核发育是在脱离花药内环境的状况下独立进行的，这是花粉培养不易成功的重要原因（胡含，1986）。6 展望花粉培养已被广泛运用，主要用于减数分裂、花粉生长机制的研究，生理、生化、遗传等基础理论的研究。在遗传育种方面花粉培养可以缩短育种周期，为新品种的培育开辟了新途径，提高了目标基因型的选择效率；用于远缘杂交育种，克服杂种不育性；便于隐性突变体得筛选，大大提高突变育种的工作效率。花粉培养中的诱导单倍体植株的发育调控及其分子机理研究不够，小孢子的诱导机制、启动机理、</p>
