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1、枯草芽孢杆菌HS-A38产抗菌脂肽Bacillomycin D的组分分析及鉴定 枯草芽孢杆菌HS-A38产抗菌脂肽BacillomycinD 的组分分析及鉴定 刘佳欣，丛丽娜*，李成，董亮，张永吉，齐建权 大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034 摘要：对一株枯草芽孢杆菌HS-A38产生的脂肽类物质进行分离鉴定及抑菌活性研究。通过酸沉淀分离和有机溶剂抽提的方法，从枯草芽孢杆菌HS-A38发酵液中得到脂肽粗提物LP，产率为1.956g/L。利用薄层色谱和茚三酮染色法确定该脂肽粗提物中存在四个组分，分别为LP1，LP2，LP3和LP4；抑菌活性检测显示，组分LP3对两株海洋致病菌副溶血性弧菌
2、和铜绿假单胞杆菌的活性较高。组分LP3经硅胶柱层析纯化分离后，应用反相高效液相色谱（RP-HPLC）和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对该组分做进一步纯化和鉴定。分析表明，LP3样品在保留时间2028min产生单峰团LP3-1，其纯度为85.24%；经MALDI-TOF-MS分析和数据比对，组分LP3-1中的主要成分为杆菌霉素BacillomycinD。 关键词：枯草芽孢杆菌；脂肽类物质；分离纯化；抑菌活性 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，该菌在自然界中广泛存在，无毒无害不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗
3、菌活性和极强的抗逆能力1。自1945年Johnson2等报道枯草芽孢杆菌产生抗菌物质后，半个多世纪以来人们从枯草芽孢杆菌的不同菌株中发现了60多种抗生素。枯草芽孢杆菌作为有效益生菌产生的抗菌物质大多为低分子抗菌脂肽（Lipopeptide）3。因其独特的化学组成和两亲性的小分子肽结构，具有低抗药性、低毒、抗菌谱广、热稳定性高、生物可降解等优点4,5，是一类绿色、安全、高效的抗生素替代品，又称为脂肽类抗生素。 枯草芽孢杆菌产抗菌脂肽，主要有伊枯草菌素（Iturin）、表面活性素基金项目：辽宁省自然科学基金项目（201602047）；国家海洋公益性行业科研专项项目(201405003)；辽宁省教育
4、厅重点实验室（LZ2014029） 作者简介：刘佳欣（1992），女，硕士研究生。E-mail：liujiaxin_联系电话：18842634070通讯作者：丛丽娜（1962），女，教授。E-mail： -1- （Surfactin）、芬荠素（Fengycin）三大环肽家族，其中伊枯草菌素是由枯草芽孢杆菌产生的一大类脂肽类化合物，家族成员包括IturinA、B、C、D、E，杆菌霉素(Bacillomycin)D、F、L以及抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)等6。这些抗菌脂肽的共同特征是分子量较小，约1kD左右，含有D，L-构型氨基酸和-脂肪酸等一些特殊结构。因为氨基酸呈环状排列，所以称为
5、环脂抗菌肽7。 JasimB等8从枯草芽孢杆菌BmB9发酵液中提取出三大环肽家族物质。目前抗菌脂肽的研究主要集中在三大环肽家族，而对于其他同系物的报道相对较少。其中，杆菌霉素BacillomycinD属于Iturin家族的结构类似物，与Iturin家族相比，其氨基酸组成差异较大。Aranda等9认为伊枯草菌素与真菌细胞膜的磷脂双分子层相互作用，可形成伊枯草菌素聚合物或形成脂肽磷脂、脂肽磷脂甾醇聚合物，使细胞膜离子通道通透性增加，导致细胞内容物的释放，从而引起真菌细胞的生长抑制或者死亡，因此BacillomycinD不仅抑制细菌的生长还可以抑制真菌的生长。 本文所用枯草芽孢杆菌（B.subtil
6、is）由本实验室分离于大连渤海海域刺参肠道中，通过进一步研究发现，其产生的活性物质具有广谱抗菌活性，尤其对水产养殖中的致病菌，革兰氏阴性菌如铜绿假单胞杆菌，副溶血性弧菌均有很好的抑制作用。结合薄层色谱（TLC）、硅胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）对发酵液提取物LP进行分离提取活性最强组分LP3-1，进一步通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对分离得到的LP3-1进行分析，经鉴定其主要成分为杆菌霉素BacillomycinD。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株 实验菌株为枯草芽孢杆菌（B.subtilis）HS-A38由本实验室分离筛选并保藏。供试
7、指示菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、溶壁微球菌（Micrococcuslysodeikticus）、副溶血性弧菌（Vibroparachaemolyticus）、铜绿假单胞杆菌（Pseudomonasaeruginosa）、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）均由本实验室保存。 1.1.2培养基 -2- Zobell2216E培养基：酵母膏0.1%，蛋白胨0.5%，磷酸铁0.01%，琼脂1.5%2.0%，pH7.2。 菌株HS-A38发酵培养基：葡萄糖1%，牛肉膏1.5%，磷酸氢二钾0.5%，pH自然。 LB培养基：酵母提取物（YE）0.5%
8、，胰蛋白胨（TRY）1%，NaCl1%，pH 7.27.4。固体培养基添加1.5%2.0%琼脂。 YPDA培养基：酵母提取物（YE）1%，胰蛋白胨（TRY）2%，去离子水80mL。灭菌冷却至60时，向其中加入10%10D（葡萄糖）和10A（腺嘌呤）。固体培养基添加1.5%2.0%琼脂。 1.1.3主要试剂和仪器 茚三酮购自国药集团化学试剂有限公司，其他试剂均为国产分析纯或进口色谱纯。硅胶填料，购于青岛海洋化工厂；TLC分析板，德国Merck公司；制备型硅胶板，青岛海洋化工厂；层析柱，北京欣维尔玻璃仪器有限公司。ZF1-2型暗箱式紫外分析仪，上海精密仪器仪表有限公司；UnitaryC18柱，Ac
9、chrom华谱新创科技有限公司；高效液相色仪，美国Waters公司。MALDI-TOF-MS5800，美国ABSciex公司。 1.2方法 1.2.1菌株HS-A38发酵培养及提取脂肽化合物 斜面保藏菌株HS-A38接种至Zobell2216E液体培养基中过夜培养，再按5%接种至发酵培养基中，30，180r/min培养48h，制备2L发酵液10。粗提物制备如图1所示，即得到抗菌脂肽粗提物LP 。 图1粗提物制备流程图 1.2.2脂肽粗提物LP的抑菌谱测定 采用牛津杯法对菌株HS-A38的脂肽粗提物进行抑菌活性测定。该粗提物用 -3- 无水甲醇充分溶解至终浓度10mg/mL作为样品组，无水甲醇作
10、为对照组，分别用五种指示菌，包括革兰氏阳性菌溶壁微球菌和金黄色葡萄球菌，革兰氏阴性菌副溶血性弧菌和铜绿假单胞杆菌以及真菌酿酒酵母，将其中四株细菌培养液均匀涂布于LB固体培养基，真菌酿酒酵母涂布于YPDA固体培养基，待平板干透向牛津杯中加样，每组牛津杯加样量200L。分别将实验组及对照组进行3次平行试验。 1.2.3薄层色谱法对抗菌脂肽粗提物LP的初步鉴定 采用薄层色谱法（TLC）技术及紫外检测技术对该粗提物LP进行组分分离与分析。称取10mg粗提物用600L氯仿和300L甲醇（体积比为2：1）11充分溶解，粗提液过0.22m的针孔式有机滤膜进行除杂除菌，样品再用毛细管分别点样于两块TLC板上。
11、然后在展层缸中展开，展开剂为氯仿：甲醇：水：冰乙酸=65：30：4：4。 TLC板展层后干燥显色，其中一块薄板采用茚三酮染色法（0.5%茚三酮水溶液）直接染色，另外一块薄板采用暗箱式紫外分析仪在254nm处观察分离开的荧光斑点位置。前者茚三酮染色验证粗提物脂肽的组分数，后者荧光显色避免染料对脂肽理化性质的改变，便于制备板更好的分离和活性鉴定。 1.2.4制备型硅胶板对LP各组分的分离及抑菌活性检测 采用制备型硅胶板（GF254）对粗提物LP的四种组分LP1，LP2，LP3和LP4进行分离。样品准备和展开条件同1.2.4，但为了得到一定量的各个组分，板上点样10组，展开后分别割取同行分离的单组分
12、斑点的硅胶，于8000rpm离心5min，去除硅胶保留上清。LP1，LP2，LP3，LP4上清液作为样品组，无水甲醇作为对照组，同1.2.3的条件测定该样品的抑菌作用。 1.2.5硅胶柱层析分离粗提物LP的活性较高组分 进一步采用硅胶柱层析对发酵粗提物LP进行单组分分离。选用洗脱剂为氯仿/甲醇10：0、9.5：0.5、9：1、8.5：0.5、8：2、7.5：2.5、7：3、6.5：3.5、6：4，每个柱体积200mL的梯度洗脱方式12逐级洗脱分离粗提物，用30mL试管定量收集，氮吹仪浓缩。以粗提物LP作为Marker，浓缩后的梯度洗脱组分作为样品组，在TLC分析板上点样、展层，并做紫外分析，直
13、到活性较高产物LP3完全洗脱下来。 1.2.6活性化合物LP3的液相色谱分析 -4- 将上述制备的具有抗菌活性较强的脂肽组分LP3采用反向高效液相色谱（RP-HPLC）进一步分离纯化，选用UnitaryC18柱，取3mgLP3溶于300L色谱级甲醇中，涡旋后取200L棕黄上清用50%甲醇水溶液稀释，过0.22m滤膜，进样量10L。采用梯度洗脱，流动相为乙腈（A）：超纯水（B）；洗脱过程在40min内，A：B由5：95到95：5（即乙腈5%95%），最后10min采用100%乙腈平衡C18柱；洗脱流速为1mL/min，柱温30，检测波长210nm。本实验收集单组峰团LP3-1并浓缩，以作为下一步
14、质谱鉴定的样品，4贮存备用。 1.2.7单组峰团LP3-1的质谱分析和鉴定 采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对活性单组分物质LP3的单组峰团LP3-1的抗菌脂肽类型进行初步确定。将经硅胶柱层析和RP-HPLCC18收集合并的分离纯化所得的抗菌活性组分，应用MALDI-TOF-MS技术及DataExplorer软件准确分析其分子量。分析条件为：基质DHB，激光束强度5500，电压1560kV，检测范围900Da1600Da。2.结果与讨论 2.1脂肽类粗提物LP的制备及抑菌谱测定 根据1.2.1的培养方法获得枯草芽孢杆菌（B.subtilis）HS-A38发酵液，
15、采用盐酸沉淀和有机溶剂抽提的方法得到脂肽类LP粗提物。称其菌体湿重及粗提物LP质量得到产率，其指标如表1所示。 表1抗菌脂肽粗提物的性状及产率 性状 棕黄色粉末菌体湿重34.425g/L产率1.956g/L 图2中显示该粗提物对四种革兰氏阳性菌和阴性菌以及一株酿酒酵母真菌均具有明显的抑制作用，尤其对海洋致病菌副溶血性弧菌和铜绿假单胞杆菌的抑菌活性更为突出。研究表明，抗菌脂肽对细菌，真菌等微生物的抗菌作用上有所差异，如Iturin主要抑制真菌生长，Surfactin主要抑制细菌、病毒、支原体生长， -5- Fengycin对丝状真菌有强烈的抑制作用13。而本研究中发酵液粗提物LP对一株真菌类酿酒酵母有明显的抑制作用，这说明该抗菌脂肽化合物里可能存在Iturin 及其家族同系物的抗菌肽。 图2脂肽类粗提物LP的抑菌作用 A：金黄色葡萄球菌（S.aureus）；B：溶壁微球菌（M.lysodeikticus）；C：副溶血性弧菌（V.parac
