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1、法 医 学 院 官 大 威 宏观 微观 超微结构 基因水平 组织形态学研究技术的种类: 一、病理大体组织标本的染色方法 在标本制作中,为了某种特殊目的,突出显示标 本的重要部分,借助组织切片的特殊染色方法对标本 进行染色,将病变器官及不同组织成分用染料染成不 同的颜色,以便于区分大体标本的不同成分和病变特 点,如: 脂肪组织染色法 目的:主要用于心、肝、肾脂肪变性,动脉粥样 硬化大体标本的染色 试剂:苏丹或苏丹 结果:病变处脂肪组织呈橙黄色 早期心肌梗死染色法 目的:显示早期心肌梗死的区域 试剂:0.1% NBT(硝基四唑蓝) / 0.2 mol / L PBS (pH 7.6) 方法:将2-
2、3 mm 厚新鲜心肌大片放入试剂中,37 C 孵育20 min。 结果:正常心肌呈蓝色,早期心肌梗死区、纤维结缔 组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。 注意 :新鲜标本,尸检心肌不超过6小时。 二、光学显微镜下的组织学染色方法 常规HE染色(hematoxylin and eosin staining) 组织学特殊染色 1. Mallory 三染色、Masson三染色 2. 神经纤维的镀银染色 3. 其他的特殊染色,包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素 、细胞DNA和RNA的染色等 上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的 形态改变。 三、超微结构的观察 光线波长的限制,光学显微镜的分辨率极
3、限为0.2m 有效放大倍数最高不超过2000倍。 电镜的分辨率最佳可达0.14nm,放大倍率最高可达100万倍 。 第二节 免疫组织化学染色技术 Immunohistochemical technique 该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构 或分子物质和组织细胞间的成分,因此现又称为免疫 细胞化学技术。 根据标记物的不同,免疫细胞化学技术可分为: 1. 免疫酶细胞化学技术 2. 免疫荧光细胞化学技术 3. 免疫铁蛋白技术 4. 免疫金-银细胞化学技术 5. 免疫电子显微镜技术 一、免疫组织化学染色方法的原理 抗原(antigen) 1. 定义:是一类在适合条件下能激发机体免疫系统 发生
4、免疫应答,并能与免疫应答产生的效应物质( 抗体和效应细胞)在体内或体外发生特异性结合反 应的物质。抗原具有两种性能: (1)免疫原性(immunogenicity) 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。 (2)反应原性(reactogenicity)指抗原分子与抗 体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反应 的特性。 2. 抗原的分类 完全抗原、半抗原 免疫学分类 胸腺依赖抗原与非依赖抗原 外源性抗原:微生物、花粉等 内源性抗原:隐蔽的自身抗原、肿 瘤相关抗原等 临 床 分 类 同种异型抗原:人类白细胞抗原、 血型抗原 异嗜性抗原:人与其他动物、植物 等之间存在的共同抗原 抗体(a
5、ntibody) 1. 定义:机体受到抗原刺激后,通过体液免疫应答 ,B淋巴细胞活化、增殖,分化为浆细胞,由浆细 胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋 白,称为抗体。 大部分抗体电泳后位于区带,1972年国际免疫 学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白 分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin,Ig)。 2. 抗体的种类: 五类,即IgA、IgD、IgE、IgG、 IgM 免疫组织化学染色技术中,使用的抗体主要是 IgG,个别情况下使用IgG的亚型,多为IgG1。 免疫组织化学染色的反应原理及显色原理 1. 免疫组织化学染色的反应原理 染色反应的最基本原理是抗原抗体的反
6、应。 通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某 种发色剂或酶类,再通过激发发色剂或使用某种 显色剂,在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部 位产生肉眼可观察到的颜色,以确定所要检测的 抗原是否存在。 通过免疫组织化学染色技术,在光学显微镜 下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在 与否。 2. 免疫组织化学染色的显色原理 (1) 基本原理 荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其 中以酶标抗体法应用最为广泛。 直接法:是将酶直接标记在第一抗体上,用酶标抗体与 切片上待检测的组织或细胞中抗原反应,再用底物显色,显 示出所检测的目的抗原的部位。 间接法:是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和
7、性的某种分子上,检测组织或细胞内的特异性抗原物质。 间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特 异性抗体,多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠制 备的单克隆抗体。 第二抗体是第一抗体的抗体,所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物,与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量, 可提高免疫组织化学染色的敏感度。 IHC技术中,绝大多数以间接法为常用。 (2)显色的基本程序 1抗孵育切片或细胞涂片 2抗(酶标抗体) 孵育切片 发色剂显色 (核复染) (3)酶标抗体法的显色原理及显色剂 辣
8、根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP ) HRP + H2O2 HRP H2O2 HRP H2O2 + DH2 HRP + D + 2H2O HRP催化的酶促反应第一步是特异的,其余反应是 非特异的,因此,可选用各种供氢体作为显色剂,可使 反应的终产物呈现不同的颜色,如: CN(4-chloro-1-naphthol)为蓝色 TMB(tetramethyl- benzidine)为深蓝色 AEC(3-amino-9-ethyl-carbazole)为红色 DAB(3,3-diamino benzidine)为棕色 碱性磷酸酶 (alkaline phosphata
9、se, ALP) 以AS-Mx(色酚AS-MX磷酸盐)为底物,FB/FR (Fast blue/Fast red)为发色剂,生成蓝色 / 红色不容性沉淀物。 ALP标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高的 血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。 由于组织细胞内含有内源性ALP,在显色液中需加入终 浓度为2-4mol/L的左旋咪唑 (levamisole),大多数内源性 ALP活性可被抑制。 葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase,GOD ) 以葡萄糖为底物的酶,其显色方法为-D-葡萄糖67mg、 NBT 6.7mg、 PMS(吩嗪硫酸甲酯,phenazine methyl-sulfate
10、) 0.167mg、0.05mol/L PBS (pH 8.2) 10.0ml,37C孵育1小时 ,生成蓝色不溶性沉淀物,该终产物不溶于有机溶剂,切片 可经脱水、透明后封片,长期保存。 (4)核复染 在显色后,特别是用DAB显色后, 切片可用苏木素染料进行核复染,经水 化后细胞核显示蓝色,与胞质中的DAB 棕色形成对比。但用AEC显色后不能用 苏木素做核复染,因为配制苏木素染料 中使用酒精作为介质,可使AEC的红色 终产物褪色,且AEC显色后只能用水溶 性封固剂封片。 (一)ABC或SP法进行石蜡切片染色的主要步骤 1. 组织材料的采取; 2. 组织块的固定; 3. 组织块的脱水、透明及石蜡包
11、埋; 4. 石蜡切片的制备; 5. 石蜡切片的脱蜡及水化; 6. 抑制内源性过氧化物酶活性; 7. PBS洗涤切片; 8. 抗原修复或蛋白酶消化切片,修复或暴露抗原; 9. PBS洗涤切片; 10.用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清(或同时 加入BSA)孵育切片,防止抗体的非特异性吸附; 11. 用特异性一抗(单克隆、多克隆)孵育切片; 12. PBS(可加入Tween 20#,PBST)洗涤切片; 13. 用针对一抗的生物素化的二抗孵育切片; 14. 用PBS或PBST洗涤切片; 15. 滴加SP试剂或ABC试剂; 16. PBS或PBST洗涤切片; 17. DAB或AEC显色; 18.
12、自来水洗涤切片,终止显色; 19. 用苏木素做核复染; 20. 切片脱水、透明,树胶封片。 1. 组织材料的采取 活检组织 手术切除标本 尸检标本 实验组织或培养细胞 活检组织:宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内窥镜钳取的组织 体积小,因活检钳直接钳取,常受压过度而变性。因此, 活检钳的刃口必须锐利,以免组织受压,活检时应采取主要的 病灶区。 抗原在组织中的分布不均一,故病灶较大的切除标本应考虑 切取主要病灶。病灶与正常组织交界区及远距病灶的正常区。 组织标本 尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上,组织有不同 程度自溶,其抗原或变性消失或有严重的弥散现象。法医尸 检一般多在24小时以上
13、,甚至数月后,检材受死后变化影响 严重,而影响染色结果。手术切除的组织较新鲜,取材后应 立即固定,以保存组织结构和抗原。 实验动物标本 新鲜,按需要取材;很多情况下是在灌流固定后取材, 组织结构和抗原保持良好,非常适用于免疫组织化学染色。 取材标本的大小 尸检组织材料大小以1cm1cm0.2cm 为宜。实验动物常 用大鼠或小鼠,其脏器体积小,有利于取材。一般标本体积 不宜过大,防止固定不透,影响抗原的保存,也浪费试剂。 2. 组织块的固定、水洗 (1)固定液:种类较多,常用的有以下2种: 4% 甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法: 10 ml 40% 甲醛 (formalin)
14、+ 90ml PBS 使用新鲜甲醛,久存甲醛可分解,形成白色沉淀(多聚甲醛), 还可形成甲酸,影响染色结果。 4% 多聚甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法:40g多聚甲醛(paraformaldehyde)+500 ml 0.1 mol/L PB (pH 7.2-7.4),搅拌、加热至60 C,同时滴入1N NaOH 至溶 液完全透明。冷却后用1N HCl 调PH 值至7.2-7.4,再用0.1mol/L PB将溶液加至1000ml。 固定时间:一般根据组织块大小及性质,固定2-24小时。 固定原理:甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。 甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反应,并能
15、保存脂类和类脂体。 不利作用:甲醛使组织中蛋白分子发生交联,使所检测的 抗原决定簇被封闭,影响抗原抗体的结合。 (2)水洗 冲洗时间与标本的种类、组织块的大小和固定时 间长短有关。尸检组织和大动物组织一般冲洗24 小时,小动物组织冲洗210小时。 新鲜标本固定时间短,冲洗时间也相应缩短,固 定时间长的标本,冲洗时间也需延长。 冲洗时组织放在广口瓶中,瓶口用纱布罩好并扎 紧,防止组织块漏出。用一根适当的胶管,一端 接自来水,一端插入瓶底,使水缓慢流出,或将 组织块放入洗涤筐中,放在水盆内冲洗。 对于过小组织或穿刺组织和小动物组织多次换水 浸泡即可。 3. 组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋 (1)脱水 脱水剂:酒精、丙酮、异丙醇、正丁醇,最常 用酒精。 酒精可以与水以任何比例混合,脱水能力强, 并可硬化组织。酒精对组织的穿透速度很快,对组 织有较明显的收缩作用。为避免组织过度收缩,应 从低浓度开始,然后再依次增加其浓度。在常温下 或4 C下进行,以减少抗原的损失。 70% 80% 90% 95% 100% 100% (2)透明 为使石蜡能浸入组织块,组织经脱水后,必须经 过一种既能与酒精相溶,又能溶解与石蜡相溶。通 过溶剂的媒介作用而达到石蜡浸入组织块的目的。 透明剂:二甲苯、苯、甲苯、氯仿等,最常用 二甲苯。 一般经过23次纯二甲苯溶液透