免疫亲和纯化和免疫沉淀讲解

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1、免疫亲和纯化和免疫沉淀技术 泸州医学院免疫学教研室 刘佳佳 20010年4月 亲和层析及沉淀的用途 亲和层析及沉淀被认为是分离纯化酶及 蛋白质的强有力的技术手段，这种方法可 以较经济有效地使用配基，能够大规模、 快速、特异性地分离、纯化酶及蛋白质。 蛋白质的功能 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物功能 的执行者，担负着生物催化、物质运输、运 动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功 能。 蛋白质分离纯化 蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混 合物之中分离纯化出所需要得到的目的蛋白质的 方法。蛋白质分离纯化技术是当代生物产业和生 命科学研究当中的核心技术。该技

2、术难度和成本 均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游 蛋白质分离纯化当中。 生物工程上游技术:是理论的研究, 技术的开发等, 如：基因工程、蛋白质结构和功能研究等。 生物工程下游技术：一般包括产物（一般为蛋白质 ）的预处理及分离纯化；产品的成型加工和质量监控等 一系列单元操作和过程中的主要技术,其中生化产物及 发酵产物的分离纯化是其核心内容。下游技术是生物工 程重要组成部分,是生物高科技技术实现产业化的关键 ，如：酶工程 , 发酵工程等（提取干扰素、胰岛素和 酶等）。 蛋白质分离纯化的意义 从生物材料中分离制备蛋白质，研究其结构与功能，对 于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意

3、 义。 工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需 要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦 芽糖、糊精以及糖浆等。 医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。 基因工程的需要：DNA合成酶、RNA逆转录酶等。 蛋白纯化策略 分离蛋白质常用的纯化方法有超速离心 和梯度密度离心法、盐析法、电泳、凝胶过 滤（分子筛）、离子交换层析、亲和层析以 及高效液相色谱等方法 。亲和沉析技术 是纯化各种生物大分子最有效的方法之一。 超速离心 是分离亚细胞及蛋白质大分子的有效手段 ，往往是进一步纯化的第一次过筛。超速离心又分差 速离心和梯度离心。用超速离心或梯度离心分离和纯 化抗原只是一种根据蛋白的比重

4、特点分离的方法，除 个别成分外，极难将某一抗原成分分离出来。目前仅 用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲状腺球蛋白 等，以及一些比重较轻的抗原蛋白如载脂蛋白A、B等 。对于大量的中、小分子量蛋白质，多不适宜用超速 及梯度密度离心作为纯化手段。 盐析沉淀法 是最古老而又经典的蛋白质纯化 分离技术。由于方法简便、有效、不损害蛋白 抗原活性等优点，至今仍被广泛应用。 盐析法原理 盐析沉淀法的原理 因为蛋白质是亲水性大分子，所以在水溶液中有双电 层结构的水合膜，来保证分子的溶解度平衡并稳定存在。 当加入盐时，盐会电离成离子态，离子的电性破坏了蛋白 质的双电层的水合膜结构，从而使其沉降，析出。 加

5、入浓酸和浓碱是不行的，苛性的环境将使蛋白质变性 。 凝胶过滤和离子交换层析 凝胶过滤又称凝胶柱层析、分子筛层析，利用微孔凝 胶，将不同分子量的成分分离。离子交换层析是利用一 些带离子基团的纤维素或凝胶，吸附带相反电荷的蛋白 质，将蛋白质按带电荷不同或量的差异分成不同的组分 。这两种层析如能共同应用或者反复应用其中的一种， 皆可将某一蛋白质从一复杂的组分中纯化出来。 凝胶过滤(分子筛层析)图示1 凝胶过滤(分子筛层析)图示2 离子交换层析柱 亲和层析 是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子 间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。 例如抗 原和抗体（免疫亲和层析）、 酶和酶抑制剂（或配体 ）

6、、酶蛋白和辅酶、激素和受体等之间有一种特殊的 亲和力，在一定条件下，它们能紧密地结合成复合物 。如果将复合物的一方固定在不溶性载体或共价结合 在一种惰性的微珠上，则可从溶液中专一地分离和提 纯另一方。与上述其他纯化方法相比，亲和层析能产 生相当高的纯化作用。另外，此法的优点是迅速，有 时仅一步即可达到纯化的目的。 免疫亲和纯化技术 亲和纯化(affinity purification)是基 于目标分子与固定化配体的特异性 相互作用(如：抗原-抗体)。亲和技 术可用来从混和物中分离特定分子 。捕获目标分子用于相互作用研究, 或从反应体系中去除某一成分。 免疫亲和纯化原理 免疫亲和纯化是一种分离各

7、种生物大分子最有效的方法 特点： 1、高纯化率，通常为常规纯化的1,000-10,000倍以上。 2、由于内在的背景限制，如目标抗原量非常稀少，需与其他方法结 合才能获得均质性产物。 3、快速纯化抗原，层析柱常可重复使用。可按照不同规模进行，半 天内即可完成。 4、不仅适用于纯化抗原，也可用来分离经过初步纯化的抗体，乃至 所有能与相应配体有效结合的生物分子。 5、抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性，能大量分离天 然状态或近似天然状态的抗原。 6、需要适当纯化的抗体，不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析， 但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠 。 7、不能用于定量测定。

8、 免疫亲和纯化技术发展历史：最早是将抗体作为一种结合剂 用于免疫亲和纯化，根据其自身交联产生大量多聚体和不溶 性基质原理收集抗原。随后利用抗体与惰性微珠共价结合， 虽然这是一种简单的结合，但抗体的许多反应性因缺乏定位 作用或抗体的过量结合而丧失。通过研究发现，抗体与蛋白 A和蛋白G微珠共价连接后更容易与抗原结合。将具有良好抗 原结合特性且来源广泛的各种单克隆抗体制成免疫亲和层析 柱，已成为一种最适用和有效的纯化方法。亲和层析技术最 先是由Cuatrecasas等人建立（1968年）。 BCX2003P2.PPT 影响免疫亲和层析纯化效果的因素 抗原初始相对浓度（即纯度）：是决定最终产物纯度 极

9、为重要的因素。 抗原与抗体的亲和力：是免疫亲和纯化层析过程中最 麻烦的问题。高亲和力抗体（10-8 mol/L)能在1 h以内 达到有效的分离，而低亲和力的抗体( 10-6 mol/L）即 使在高浓度时也不能结合溶液中的全部抗原。使用针 对同一抗原多个表位的多克隆抗体以增强亲和力的方 法固然可结合较多的抗原，但增加了洗脱的困难性。 只有当所需的最终产物为变性蛋白时，才选用识别多 个表位的抗体。 免疫亲和纯化的关键：高亲和力与容易洗脱的优 化组合。 常见错误是将低亲和力和容易洗脱等同看待。 1亲和层析支持物的选择:作为亲和层析支持物须 符合以下要求：非特异性吸附低；液体通过 时流速要快；在各种p

10、H和高浓度盐溶液中稳 定；必须有合适的、丰富的化学基团，能有效 地与蛋白质或其它化合物结合；必须带有丰富 的微孔，以增加结合容量。符合以上5个条件的 支持物有琼脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其 中常用的是琼脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B） 。 2配体的选择:所谓配体系指具有亲和性的双方，作为免疫亲 和层析专指抗原与抗体。良好的配体必须具备以下3个条件。 （1）抗原或抗体必须单一特异性：抗原或抗体的纯化效果决定于固相中 配体的纯度。 （2）抗原与抗体之间必须有强的亲和力：这种亲和力决定于抗原决定簇 的性质和数量。对抗体来说还决定于抗体来源动物的种类和免疫时间，如 马抗血清亲和力较低，

11、免疫血清亲和力较高；免疫时间短的亲和力低。但 是，亲和力太强也不利，因为解离抗原抗体复合物所需要的条件就要强烈 ，从而可造成蛋白质的变性。例如用低pH（1.52.5）或高盐（如6 mol/L 盐酸胍）可使部分抗原或抗体活性降低或丧失。 （3）配体必须有一个适当的化学基团：这个基团不参与配体和大分子的 特异结合，但可用来连接支持物，而且这种连接不应当影响配体与大分子 结合的亲和性。 3抗原或抗体与支持物的结合将抗原 或抗体结合到支持物上的方法目前有20多 种，但可归结为载体结合法、物理吸附法 、交联法和网络法4类。 结合法的一般步骤是先活化支持物上的 功能基团，然后将抗原或抗体连接到这些活 化的

12、基团上。用来发生交联的化学反应必须 足够温和，不致使抗原或抗体遭到破坏。交 联后，要彻底清洗支持物，以除去剩下的未 交联的物质。 最常用的支持物是Separose 4B，将此支持物与溴化氰 在pH11时进行处理，则能使支持物活化。此时溴化氰与支持 物上的羟式反应形成氨基甲酸酯基团。加入溴化氰的量取决 于支持物的量。如果希望取代程度提高，则加入溴化氰的量 也要提高。交联时首先要注意加入抗原或抗体的浓度。通常 在交联反应混合物中的交联蛋白质浓度应是亲和分离浓度的 2030倍。这样，溴化氰浓度也必须提高到 200 mg/ml凝胶 。若希望最终产物含量较少，所加入的溴化氰也应减少。交 联时的pH也应注

13、意，pH9.510时，活化的琼脂糖珠很不稳 定。降低pH，也就减少了能反应的配体浓度，交联量就会减 少。 亲和层析中常用小分子抗原或其它化合物与支持物交联， 由于载体空间的位阻而影响了与抗原或其它亲和物的结合， 产生了所谓的无效吸附。另外，Sepharose 4B交联时要求有 一游离的氨基，如果该抗原有具氨基则难于交联。基于这两 个原因，通常在琼脂糖与抗原之间接上不同长度的“手臂”。 必要时这些“手臂”末端可接上游离氨基，以与不带氨基的配 基偶联。常用的带“手臂”琼脂糖有氨基琼脂糖（二亚胺）、 羧基琼脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰琼脂糖（0-溴乙酰-N羧 基琥珀酰胺）、重氮盐衍生物琼脂糖和疏基琼脂糖

14、等。这些 带“手臂”的琼脂糖有商品供应，使用极为方便。 亲和纯化的多克隆抗体 单克隆抗体 信号强度(抗体结合容量） 非常好 视抗体而异，但应该非常好 特异性 非常好 非常好 优点 洗脱峰形易分辨（已知）， 应用不受限制，特异性强 特异性强 缺点 制备困难，应用受限 需要筛选合适的抗体 注：不推荐将未经纯化的多克隆抗体或混合的单克隆抗体用于免疫亲和纯化。 免疫亲和纯化层析的基本操作步骤：交联结合洗脱 1、将抗体与基质（微珠）共价交联并制备抗体亲和层析柱。 2、将抗原结合到抗体-基质微珠上。 3、抗原的洗脱。 亲和层析条件的选择： （1）支持物与抗原或抗体结合后，还可能有多余的活性基团， 为了封

15、闭这些残基团，必须用无关蛋白质或三乙醇胺过一次柱，以封闭活性基团 。 （2）去掉未结合及结合不牢固的蛋白质。 先用0.2 mol/L NaHCO2（含 0.1 mol/L NaC1，pH 9.0）洗脱23个柱体积，再用解脱剂处理一次亲和 层析柱。 （3）解脱剂有多种：常用的有0.2 mol/L pH 2.8 甘氨酸HC1缓冲液、 0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液、7 mol/L脲、5 mol/L NaI、3 mol/L硫氰酸 钾（或钠）、1 mol/L乙酸、6 mol/L盐酸胍、0.2 mol/L KC1等。作为抗原 抗体解脱剂，最多用的是3 mol/L硫氰酸钾（或钠）及0.1 mol/L pH 2.4甘 氨酸缓冲液。 抗体亲和层析柱的制备： 抗体与固相基质的连接： 1、最常用的基质为蛋白A和蛋白G微珠， 可与抗体的Fc功能区特异结合。 2、将抗体直接与一种活性微珠（表达活 性的反应基团）连接。 抗体与微珠的结合方法 试剂 优点 缺点 与抗体结合的基团 蛋白A 抗体定向确切， 粒柱还能与其他无关 二甲基庚二酸酯 -NH2 容易结合 的抗体结合，昂贵 蛋白G 抗体定向确切， 粒柱还能与其他无关 二甲基庚二酸酯 -NH2 容易结合 的抗体结合，昂贵 活性微珠 价廉，不结合 抗体无定向性，且常 羰基二咪唑 -NH2 其他无关抗体 因过量结合而损伤 溴化氰 -