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1、南方医科大学2 0 0 5 级博士学位论文 肿瘤相关蛋白R a i B 和S T A R D 7 对肝癌细胞 生物学影响的实验研究 P r i m a r yS t u d yC o n c e r n e dt h eB i o l o g c a lI n f l u e n c eo nH C C P e r f o r m e dB yT u m o rR e l a t e dR a l Ba n dS T A R D 7 课题来源：国家8 6 3 基金项目( N o 2 0 0 6 A A 0 2 A 3 1 1 ) 专业 名称 学位申请人 指导教 师 答辩委员会主席 答辩委员会成
2、员 免疫学 潘华政 李明教授 余新炳教授 朱家勇教授 李英杰教授 黎诚耀教授 何庆瑜教授 高毅教授 申洪教授 论文评阅人陈观今教授 孙晗笑教授 董文其教授 200 8 年0 4 月15 日 博士学位论文 肿瘤相关蛋白R a l B 和S T A R D 7 对肝癌细胞 生物学影响的实验研究 博士研究生：潘华政 导师：李明教授 摘要 肝癌是一种严重威胁人体健康的恶性肿瘤，其发病率在所有恶性肿瘤中据 第3 位。肝癌在东南亚地区具有较高的发病率，中国广东、台湾两地是肝癌的 高发地区。肝癌的发病机制目前仍不是特别清楚，一般认为与病毒侵袭、化学 污染物的接触、环境及饮食习惯、遗传易感性及其他方面的因素有
3、关。目前临 床对于肝癌的治疗方法以手术治疗为主，配合放疗和化疗，但是由于肝癌诊断 较为困难，发现时多为晚期，因此治疗效果并不十分显著。恶性肿瘤的基因诊 断与治疗是近年来研究和开发的热点，同时发现一些相对于恶性肿瘤的诊断及 治疗靶标，但是由于肝脏器官体积较大、功能复杂，因此迄今为止，还并没有 发现针对于肝癌的诊断及治疗靶标。 R a l B 是小G 蛋白R a l ( R a sl i k e ) 家族的成员之一，R a l 家族由R a l A 和R a l B 组成。R a l 是R a s 超家族的一个成员，具有参与介导许多不同细胞外信号活化的 潜能。R a l 蛋白与R a s 具有5
4、5 的氨基酸同源性，其作为辅助因子并活化，从而 参与肿瘤基因R a s 诱导的细胞转化，R a l 通过相应的信号通路和不同的效应因子， 引起基因转录的改变从而影响细胞形态的改变，进而影响细胞的转化。小G 蛋 白R a l 家族参与肿瘤的发生、侵袭和转移，但对于R a l 家族成员R a l A 和R a l B 的各自生物学功能并未完全研究清楚。R a l B 对于维持肿瘤细胞的存活具有特异 性的作用，R a l B 还能够抑制不同肿瘤细胞的程序性死亡，R a l A 的生物学功能主 要在于促进不同的肿瘤细胞锚定非依赖性增殖，推测R a l A 和R a l B 可能具有协 同参与肿瘤转化、
5、介导肿瘤细胞增殖和存活信号。同时，R a l B 能够增强肿瘤细 中文摘要 胞的活力，据有促进不同肿瘤细胞迁移的生物学作用。 S A T R D 7 是一编码2 9 5 个氨基酸残基，分子量为3 4 7 k D a 的新型蛋白质，其生 物学功能至今未明。通过生物信息学分析，发现其全长序列中含有一个类固醇 敏感性调节蛋白( S T A R ) 相关脂类转运体结构域( S T A R T ) 。S T A R T 涉及脂类结合 介导的细胞信号转导、脂类转运和调节。S T A R T 发生突变或错误表达与基因错配、 自身免疫性疾病以及肿瘤相关。对于S A T R D 7 的研究，目前限于对其在m R
6、 N A 水平 上的研究。研究发现S A T R D 7 在绒毛膜癌细胞，结肠直肠癌细胞和肝癌细胞中高 表达。通过计算机的同源性检测发现推断的蛋白质与磷酸卵磷酯转移蛋白 ( P C T P ) 具有同源性，提示S A T R D 7 参与磷脂介导的肿瘤信号活动。 目前虽然对于R a l B 和S A T R D 7 通过相应的实验研究，对其生物学功能有了 一定方面的了解，但是相对R a l B 和S A T R D 7 在肝癌方面的研究并未见相应的报 道，因此，我们设计了一系列的实验，通过R a l B 和S A T R D 7 对肝癌细胞生物学 特性，如肿瘤细胞的增殖、存活、侵袭和转移的影响
7、的研究，对于R a l B 和S A T R D 7 的功能有迸一步的了解，从而为未来将其作为肿瘤生物治疗靶标的可能性提供 理论依据。 方法：首先，采用W e s t e r n b l o t 技术对R a l B 和S T A R D 7 在不同的肝癌细胞和 其他肿瘤细胞表达进行鉴定。同时，采用免疫组织化学技术、免疫细胞化学技 术对R a l B 和S T A R D 7 分别进行组织和亚细胞定位。对于R a l B 和S T A R D 7 分别采用肝 组织细胞器分离技术和激光共聚焦技术进一步鉴定其在组织和细胞中的定位。 其次，采用R T - P C R 技术从2 9 3 T 细胞中扩增
8、出R a l B 和S T A R D 7 目的基因。将目 的基因通过转化连接至U p M D l 8 - T 载体上，提取含有目的基因的质粒，经P C R 、双 酶切、测序鉴定后，将经双酶切的目的基因与真核载体p c D N A 3 1 ( 一) 和p D s R e d 。一C 3 连接，经转化得到含有R a l B 和S T A R D 7 目的基因的重组质粒，后经双酶切重组质 粒，测序正确后将p c D N A 3 1 ( 一) R a l B 转染至S M M C 7 7 2 1 细胞，将 p c D N A 3 1 ( 一) S T A R D 7 转染至H e p G 2 细胞，
9、并将转染后的细胞采用G 4 1 8 筛选出稳定 表达株，用于进一步的实验。 再次，采用M T T 法分别检测稳定转染p c D N A 3 1 ( 一) R a l B 、转染p c D N A 3 1 ( 一) l I 博士学位论文 空载体的S M M C 7 7 2 1 的细胞，转染p c D N A 3 1 ( 一) S T A R D 7 、转染p c D N A 3 1 ( 一) 空载体 的H e p G 2 细胞的生长状态；通过饥饿实验分析高表达R a l B 对于肿瘤细胞存活状态 的影响；通过流式细胞仪分析分析高表达R a l B 对肿瘤细胞凋亡的影响；通过 T r a n s
10、w e l l 方法检测高表达R a l B 对促进肝癌细胞侵袭转移能力的影响； 最后，通过凝胶迁移实验分析高表达R a l B 对N F - KB 的激活能力，以及从m R N A 水平检测转染R a l B 基因对于细胞周期蛋白B 。、D 。、E 。、E 2 以及基质金属蛋白酶删P 2 表达变化的影响，从而初步探讨R a l B 对于肝癌细胞生长及转移的作用机制的影 响。 结果： 1 通过W e s t e r n b l o t 技术检测T R a l B 和S T A R D 7 在C h a n g 、B e l 7 4 0 2 、Q G Y 7 7 0 3 、 S M M C 7
11、7 2 1 和H e p G 2 细胞中的表达，结果显示同正常肝细胞C h a n g 比较，R a l B 在 B e l 7 4 0 2 和S M M C 7 7 2 1 中表达增高，其中在S M M C 7 7 2 1 中增高明显，而在Q G Y 7 7 0 3 和 H e p G 2 中表达并不明显；S T A R D 7 在B e l 7 4 0 2 、Q G Y 7 7 0 3 和H e p G 2 中表达增高，在 S M M C 7 7 2 1 中不表达。同时检测了R a l B 在其他肿瘤细胞中的表达，发现R a l B 在不 同肿瘤细胞中有不同程度的高表达。 2 通过免疫组织
12、化学实验检测了R a l B 和S T A R D 7 在人肝癌组织中的表达，结 果表明同正常肝组织相比，R a l B 在肝癌组织的细胞膜上表达，同时在细胞核中 有散在的表达；S T A R D 7 主要在肝癌组织的胞浆中表达。通过免疫细胞化学技术 和肝组织细胞器分离技术，显示R a l B 主要在细胞膜和细胞核中表达。免疫细胞 化学技术和激光共聚焦显示S T A R D 7 在细胞浆中表达，并在核内有散在的表达。 3 成功构建真核表达载体p c D N A 3 1 ( 一) R a l B 、p c D N A 3 1 ( ) S T A R D 7 ，以及 带有红色荧光标记的融合表达真核
13、表达载体p D s R e d 广C 3 R a I B ，p D s R e d 厂C 3 S T A R D 7 。 4 用脂质体转染法将重组质粒p c D N A 3 1 ( 一) R a l B 转染至肝癌细胞 S V ! C 7 7 2 1 ；将重组质粒p c D N A 3 1 ( 一) S T A R D 7 转染至肝癌细胞H e p G 2 。采用R T P C R 及W e s t e r n - - B l o t 法检测，经G 4 1 8 筛选获得的稳定转染细胞，分别从m R N A 及蛋白 水平鉴定，同对照组比较，结果表明转染细胞中R a l B 和S T A R D
14、7 的表达量增高， I I I 中文摘要 提示成功构建稳定表达R a l B 和S T A R D 7 的细胞株。 5 用同样方法将p D s R e d 。- C 3 R a l B 和p D s R e d 。- C 3 S T A R D 7 真核表达质粒转染 入2 9 3 T 和肾癌7 8 6 0 细胞，通过观察发现R a l B 集中表达于细胞核和细胞膜； S T A R D 7 贝U 定位于胞浆中。 6 采用M T T 法检测p c D N A 3 1 ( 一) R a l B 稳定转染的S M M C 7 7 2 1 细胞，同转染 p c D N A 3 1 ( 一) 空载体的S
15、 M M C 7 7 2 1 细胞的生长特性比较；p c D N A 3 1 ( 一) S T A R D 7 稳定 转染的H e p G 2 细胞，同转染p c D N A 3 1 ( 一) 空载体的H e p G 2 细胞的生长特性比较，结 果表明R a l B 的过表达能在细胞生长的早期促进肝癌细胞的增殖，而过表达 S T A R D 7 对于肝癌细胞的生长并无明显的促进作用。 7 T r a n s w e l l 实验显示同转染p c D N A 3 1 ( 一) 空载体的S M M C 7 7 2 1 细胞相比，过 表达R a l B 的S 删C 7 7 2 1 细胞的侵袭转移水平
16、有较为明显增高，R a l B 可增强肝癌细 胞的侵袭转移能力。 8 采用无血清培养收集原点、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 的p c D N A 3 1 ( 一) R a l B 的S M M C 7 7 2 1 细胞，经流式细胞仪分析结果发现，同p c D N A 3 1 ( 一) 空载体的S 1 1 C 7 7 2 1 细胞比较 发现，过表达R a l B 可抑制S 删C 7 7 2 1 细胞的凋亡；同时，用抗R a l B 的单克隆抗体， 通过W e s t e r n - - B l o t 法检测无血清和正常血清培养的肝癌细胞中R a l B 的表达，发 现无血清培养的肝癌细胞中R a l B 的表达明显高于正常血清培养的肝癌细胞，提 示R a l B 可以抑制肝癌细胞的凋亡，维持肝癌细胞的存活。 9 凝胶迁移实验观察到转染R a l B 基因的S M M C 7 7 2 1 细胞核蛋白出现了特异 的迁移带，说明R a l B 能够在肝癌细胞中活化N F
