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1、SEC对淋巴细胞分泌TNF-的诱导作用安徽医学2006年第27卷第5期SEC对淋巴细胞分泌TNF一)【的诱导作用王凡黄强周丽英摘要目的探讨超抗原SEC的抗癌作用机制.方法采用ELISA法测定SEC在不同浓度及作用时间促淋巴细胞分泌TNFa的作用;采用RTPCR法检测SEC在不同作用时间促进淋巴细胞表达TNFa的mRNA.结果ELISA法显示:淋巴细胞在未经SEC激活之前,培养上清液中TNFa较低,经SEC激活后的第1天,培养上清液中TNFa迅速上升,到作用的第3天,TNFa上升至峰值.RTPCR显示:经SEC活化的淋巴细胞有大量TNFamRNA的表达,高峰出现于第3天.结论SEC能促进淋巴细胞
2、大量分泌TNFa.关键词金葡菌肠毒素C;超抗原;淋巴细胞;肿瘤坏死因子一aTunlornecrosisllact0lrOtsecretionoflymphocytestimulatedbySECWangFan,HuangQ,ZhouUyingDepartmentofRadiationOncology,FirstAffiliatedHospital,AnhuiMedicalUmvershy,Hefei230022AbstradObjectiveProbetoantitumormechanismofsuperantigenSEC.MeodsWemeasuredlNFainlym-phocytest
3、imulatedbySEC(indifferentdoseandtime)withELISAmethod;mRNAexpressionwasmeasuredbyusingRTPCR.ResultsAPAAPshows:ThereislittleINFabeforeusingSEC.ThelymphocytestimulatedbySECbegantosecreteINFctgreatlyatfirstday.Secretingamountreachedpeakatthethirddayanddecreasedslowlyatthe5,7,hday;RTPCRshows:Lymphocyteac
4、tivatedhaveexpressedmRNAoflNFa,contrasttothis,thelymphocyteunaetivateddidnotexpressedanymRNAofeytokine.ConclusionSECCaninducelymphocytetosecreteINFaKeywordsStaphylococcalenterotoxin;Superantigen;Lymphocyte;Tumornecrosisfactora生物治疗现已被公认为除手术,放疗和化疗外的第四种肿瘤治疗手段.高聚生作为一种超抗原,经动物实验及人体临床试验,均显示出强大的抗瘤作用.本文通过观察金
5、葡菌肠毒素C型(staphylococ.calenterotoxinC,SEC)对淋巴细胞分泌TNF一仅的诱导作用,试图对SEC高聚生的抗瘤作用机制进行阐明.资料与方法1.仪器相差显微镜:Nikon,日本.二氧化碳培养箱,ESOECBAN一311型,日本.离心机:LIM一2A,北京医用离心机厂.DNA热循环仪:PE公司.电泳仪:TS600,上海复旦生物工程研究所.全自动酶联免疫检测仪:HYPERION,USA.2.主要试剂SEC,沈阳协合制药厂.FicollHypaque淋巴细胞分离液,比重1.0770.022,上海试剂二厂.RPMI1640培养液,Sigma公司.小牛血清,杭州四季青生物工程
6、材料研究所.RNA抽提试剂TRIZOL及cDNA合成试剂盒,GIBCOBRL公司产品.357高保真Taq酶及dNTPS,Sigma公司产品.TFN一仅检测试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司.3.淋巴细胞的分离培养及活动取健康志愿者静脉血50na(肝素1250U),100mlPBS稀释,小心加人到等体积的淋巴细胞分离液,2000r/min离心20分钟,小心吸出中层的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcel1)层,加5倍PBS稀释,1000r/min离心5分钟,弃上清,将沉淀置于RPMI1640完全培养基(含20%小牛血清,青链霉素各100U/m1)3750%C
7、O:饱和湿度下培养,在上述培养基中加人SEC,使其终浓度分别为10U/ml,5U/ml,2.5U/Tnl,0u/Tnl.于用药前及用药后的第1,3,5,7天离心,收集上清液及淋巴细胞,分别置于一20及一80冰箱保存备用.4.ELISA检测淋巴细胞上清液TNF一采用双抗体夹心法,取出已平衡至室温的板条,加人标准品稀释液100至空白孔和零孔,加人上述收集的上清液和已稀释的不同浓度的标准品各100至相应孔中,用封板胶纸封住反应孔,3790分钟,洗涤液洗板4作者单位:230022合肥安徽医科大学第一附属医院肿瘤放疗科苏州大学附二院脑肿瘤研究室(黄强,周丽英)358次,除空13L#t,每孔加入已稀释好的
8、生物学标记二抗100IXl,封住板孔,37C60分钟,洗涤液洗板4次,除空白孔外,每孔加已稀释好的酶联物100IXl,封住板孔,3730分钟,洗板液洗板4次,每孔加底物A,B各1滴,避光37C15分钟,每孔加终止液1滴,混匀,即刻在450nm处读数.5.RTPCR检测细胞因子和表达(1)总RNA抽提:取上述备用的淋巴细胞,PBS洗2遍,在1X10.细胞加入1mlTrizol裂解液,反复吹打置室温5分钟,加入0.2ml氯仿,剧烈振摇l5秒,室温静置3分钟于413500g离心l5分钟,转移上层水相,加入0.5ml异丙醇并混匀,室温静置l0分钟,于413500g离心l0分钟,弃上清,加入1ml75%
9、乙醇,震荡混匀,于4C7500g离心5分钟,弃上清,超净台内干燥5分钟,加入50IXlDEPC处理水,溶液于5560,水浴l0分钟,分光光度计分析并定量,置一80备用.(2)cDNA的合成:取5(1)抽提的RNA3,OligodT1(0.5g/m1)DEPC处理水l2,置于70水浴l0分钟,冰上冷却3分钟,加入预先混匀的PCR反应混合液7l(10X反应缓冲液2l,25mmol/L氯化镁2l,10mmol/LdNTP1IXl,0.1mol/LDTr21),轻轻混匀后置425分钟,加入1IXlMMLV逆转录酶(200U/m1),混匀后于42反应50分钟,置72C15分钟终止反应,冰上冷却l0分钟,
10、离心收集反应液,加入1RnaseH于37反应20分钟,置一20备用.(3)引物合成:上海SANGER公司产品BactinF:5一AGCAAGAGAGGCATCCTCAC一3R-5一GCAGCTCATTGTAGAAGGTGT一3TNF一F:5一TGTAGGCTCGAGGTCAGATCATCTTCTCGAAC一3R:5一GCTACCAAGCTTCAGGGCAATGATCCCAAAG一3(4)PCR扩增:在50反应体系中,加入10XPCR缓冲液5,氯化镁(25mmol/L)2,dNTP(10mmol/L)1.2IXl,上,下游引物(10mmol/L)各2l,模板cDNA2IXl,TaqplusDNA
11、聚合酶1.循环条件:947分钟变性,然后9460秒,5730秒及7290秒,循环30次,72延长7分钟.2%琼脂糖凝胶电泳.安徽医学2006年第27卷第5期结果1.SEC活化淋巴细胞前后的TNF一检测结果SEC活化淋巴细胞前后培养上清液中的TNF一在未经SEC激活之前,培养上清液中TNF一较低,在37.4476.24pg/ml之间,经SEC激活后的第1天,培养上清液中TNF一迅速上升,到作用的第3天,TNF一上升至峰值,其中SEC10单位/Inl剂量组的TNF一上升到541.87pg/ml,到第5天及第7天,TNF一开始下降,从不同剂量组显示的激活效果看,SEC10U/ml剂量组激活淋巴细胞的
12、作用最强,见图1.e差7oo6oo5004oo30O20oloo0用药前第1天第3天第5天第7天作用对同图1SEC促淋巴细胞分泌TNFn作用2.SEC激活淋巴细胞mRNA的表达我们采用RTPCR法对SEC(10U/In1)作用前后的淋巴细胞(用药前,第1,3,5,7天)进行TNF一进行检测,发现与Bactin相比较,经SEC活化的淋巴细胞均分泌表达TNF一mRNA,其中以第3,5天表达量最高,见图2.图2SEC促淋巴细胞表达TNFn结果讨论1543脚697bp5I5bp3771237bp从本实验结果来看,ELISA从蛋白质水平和RtPCR从mPNA水平检测的结果都可证实.SEC诱生的CTL在S
13、EC刺激PBMC第1天就开始分泌细胞因子:TNF一可持续57天,其中,最大分泌出现在第35天.这些细胞因子可对肿瘤细胞产生直接或间接的杀伤.多年来许多肿瘤学者,特别是肿瘤免疫学家,曾设想应用肿瘤特异性细胞毒T细胞(CTL)来防治肿瘤J.这是非常令人向往的设想,因为机体杀伤安徽医学2006年第27卷第5期瘤细胞的主要效应细胞是CTL,并具有特异性,既对肿瘤细胞发挥强大的杀伤作用,而又无损于正常细胞,比化疗优越.IL一2问世以来,将IL一2与瘤细胞或肿瘤抗原,淋巴细胞在体外共孵,不仅可诱导出该肿瘤特异性CTL,以杀伤瘤细胞,而且使CTL呈指数级增殖,注人体内的CTL可高达510,未见任何毒性反应.
14、因此,世界上有权威性的肿瘤研究机构(美国国立癌症研究所,斯隆一凯特癌症研究所,法国肿瘤免疫药理研究所等)都正致力于此项研究.美国国立癌症研究所lotzw等将3例肺部有转移的肉瘤病人PBL(1210)培养于IL一2与肉瘤细胞中,经34周后,CTL增殖到11010,可维持生长达数月,且对自身肉瘤细胞的杀伤作用增加23倍,如新鲜淋巴细胞对瘤细胞的杀伤作用为85.01.9CPM,经IL一2孵育的CTL,增至253.64-15.4CPM.超级抗原是一种潜在的高效的T淋巴细胞激活剂.被超抗原激活的T淋巴细胞即CTL,其胞浆内积聚很多穿孔素和粒酶,通过细胞排粒作用分泌到瘤细胞上,聚集形成孔道,一些效应分子如
15、粒酶,TNF,分泌性ATP,多腺苷酸结合蛋白TIA一1等可以从孔道进人瘤细胞,导致细胞死亡.6J.关于TNFd在肿瘤免疫反应中的作用,体外实验早已证实TNFd可使肿瘤细胞坏死.研究发现,TNFd诱导的肿瘤细胞杀伤作用,可通过诱导靶细胞调亡这一途径实现,肿瘤靶细胞表面有一种名为FAS(APO一1)分子是TNF受体家族成员,Fas有三个跨细胞膜区和一个胞浆尾端(死亡区)这与TNFR(P55)同源,后者的死亡区与Fas完全一样.Fas与效应细胞相结合迅速可诱导靶细胞凋亡,同理,细胞表面和可溶性TNF与TNFR结合后,亦发出死亡信号导致肿瘤靶细胞调亡.此外,TNF与处于间期的肿瘤细胞质模表面的特异性受体结合,TNF一受体复合物在细胞表面形成帽状聚集并人胞形成
