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1、砷剂对肿瘤细胞的诱导凋亡作用 砷剂，主要成分为三氧化二砷(as2o3)，在祖国医药中被称为砒石。几世纪以前，砷剂就被人们用来治疗牛皮癣、风湿症、白血病、梅毒、痔疮等。目前临床上砷剂的应用主要限于用有机砷治疗锥虫病或三氧化二砷作牙髓失活剂。哈尔滨医科大学首先报道了静脉滴注as2o3治疗复发的急性早幼粒细胞白血病(apl)达到很高的完全缓解率后，上海血液研究所发现as2o3可诱导apl细胞凋亡和部分分化。近年来，国内外对砷剂与肿瘤的研究发展很快，发现砷剂对恶性淋巴系统疾病、红白血病甚至实体瘤有令人振奋的治疗效果。现就其生化作用及对肿瘤的诱导凋亡作用作一综述。1砷的生化作用砷作为微量元素，存在于正常
2、人体内。其化学形式可分为三价砷(无机砷)和五价砷(有机砷)，它们在体内的相互转换和代谢决定着砷的毒性作用。三价砷毒性较大，易在体内蓄积，主要经胃肠道缓慢排泄;而五价砷则相对毒性较低，蓄积倾向低，主要经肾脏较快排泄。进入人体后的三价砷在肝脏内还原发生甲基化，形成一甲胂酸(mma)或二甲胂酸(dma)，从而被解毒。砷是一种细胞原浆毒，细胞内的相邻巯基是三价砷的主要化学受体。应用含巯基的还原型谷胱甘肽可阻断砷剂的毒性作用。含大量巯基的还原型角蛋白结合砷剂的量为含较少巯基的氧化型角蛋白结合砷剂量的十倍。砷剂与酶分子内的巯基作用后可抑制其活性。受影响的重要酶系统有丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸酯酶、细
3、胞色素氧化酶、脱氧核糖核酸聚合酶、白介素1转化酶(ice)等，从而直接影响了细胞的代谢过程、染色体结构、核分裂等。线粒体是对砷剂作用最敏感的细胞器，三价砷消耗了线粒体内亲水的巯基后，干扰了线粒体内的离子平衡以及nad(p)h的氧化，从而干扰了线粒体的能量代谢，引起细胞功能的紊乱。砷剂是否对正常细胞有毒性作用取决于剂量，如as2o3治疗apl有效血浓度及体外研究其对肿瘤细胞作用的有效浓度均在0m0m，实验表明as2o3在此浓度下对造血干细胞影响甚小。2砷剂对肿瘤细胞的诱导凋亡作用与正常细胞不同，肿瘤细胞生长失控，分化或凋亡受阻。近年来研究表明砷剂既可诱导肿瘤细胞凋亡、部分分化，也可抑制其增殖。多
4、项研究表明诱导凋亡为其杀伤肿瘤细胞的主要机制。1开放mpt，活化caspase家族研究表明，细胞凋亡发生的关键环节不在细胞核而在细胞质。虽然凋亡细胞呈现一系列的特征性形态学变化，但这些改变仅仅是细胞凋亡的结果。凋亡细胞在被诱导产生特征性形态学改变和dna降解之前，一个最普遍的变化是线粒体膜功能的改变即线粒体的通透性改变(permeabilitytransition，pt)，这是调节凋亡的中心环节。线粒体通透性转运孔道(mpt)是位于线粒体内外膜之间的多蛋白复合体，至少包括胞质的己糖激酶、外膜的pbr、外室的肌酸激酶、内膜的ant及基质的亲环蛋白d(cyclophilind)等。mpt通过调节线
5、粒体基质中的ca2、ph和电荷，维持线粒体内环境稳定，保证氧化磷酸化通路通畅，对凋亡控制具有重要作用。砷剂与巯基结合后，导致mpt开放，线粒体跨膜电位(m)下降或消失，继之呼吸链脱偶联，谷胱甘肽耗竭，活性氧类(reactiveoxygenspecies，ros)产生及对诱导凋亡非常重要的蛋白酶活化物的释放，包括细胞色素c(cyto-c)和凋亡诱导因子(aif)，cyto-c和aif均可激活caspase，caspase可诱导凋亡。caspase即半胱氨酸蛋白酶家族。在nb4(一种apl细胞系)，u937及sh?sy5y成神经细胞瘤等细胞系中均可见as2o3等砷剂诱导的凋亡相关的caspase激
6、活2，3。根据其在细胞凋亡中的作用可分为始动(上游)caspase(caspase2，8，9，10)和效应(下游)caspase(caspase3，6，7)两大类。前者在凋亡诱导信号作用下结合特异辅因子而活化，并进一步活化后者。而caspase抑制剂(z?vad，fmk等)可阻止砷剂诱导的凋亡。因而caspase的活化级联形式是砷剂诱导凋亡的重要通路。综上所述，砷剂引起的mpt开放和m破坏是决定细胞生存与否的关键，而caspase是砷剂诱导凋亡的下游效应物，其活化可诱导细胞凋亡。2改变细胞内氧化还原状态细胞内ros的产生和抗氧化代谢的平衡往往是决定细胞生存与否的关键。蛋白的氧化作用可能是改变核
7、基因转录的重要步骤，氧化作用通过基因转录改变细胞的表型以便进一步启动凋亡的发生，且凋亡的最后阶段需要氧化过程的参与，如细胞膜蛋白的氧化能开放离子通道间接地导致细胞皱缩，通过组蛋白的氧化修饰作用导致染色体结构的改变。砷剂可使细胞内ros生成增多是由于：(1)mpt开放，线粒体内氧化呼吸链受阻，致ros外漏。(2)活化黄素蛋白依赖的超氧化物酶(如nadph氧化酶)，使h2o2产生增多，后者可通过从线粒体释放cyto-c，活化caspase-3并裂解多聚adp核糖多聚酶(parp)而介导凋亡(parp在dna受损时可识别并结合到dna断裂处被激活而参与dna的修复，是细胞凋亡中第一个被鉴定为由cas
8、pase-3降解的dna修复酶)；又可通过与线粒体巯基形成复合物而降低gsh的活性等途径使ros清除减少。故砷剂可通过改变细胞内的氧化还原状态诱导凋亡。但将细胞培养于氧浓度低于10ppm不可能产生ros的条件下，仍可发生凋亡，故这可能只是机制之一。快速调变pml?rar融合蛋白的亚细胞定位apl细胞特征性染色体易位t(15;17)导致早幼粒细胞白血病基因(pml)和维甲酸受体基因(rar)融合，表达pml-rar融合蛋白。通过转基因小鼠实验可证实pml-rar融合蛋白是apl发病的主要分子基础。体外研究表明，pml-rar融合蛋白既阻断apl细胞的分化，也使apl细胞凋亡受阻。早期认为砷剂通过
9、降解此蛋白而诱导apl细胞凋亡，称之为维甲酸受体信号通路。正常血细胞中野生型pml与rar等共定位于核体(pods)中。大多数apl细胞因pml-rar与pml形成异二聚体而使pods结构解体，阻止细胞分化及抑制凋亡。砷剂使pml，pml-rar重新共定位于pods并快速降解之。该现象与apl细胞凋亡以及二硫键还原剂二硫苏糖醇(dtt)抑制nb4 细胞凋亡与抑制pml-rar快速降解在时相上均有一定的相关性，被认为是砷剂治疗apl的机制之一。但有实验显示，在pml小鼠(不含pml基因的小鼠)，as2o3同样能抑制细胞增殖及诱导凋亡，且其诱导凋亡效应不仅见于apl细胞，还可见于非霍奇金淋巴瘤细胞
10、、慢性淋巴细胞白血病细胞及某些正常细胞，故其诱导凋亡机制是非特异性的，维甲酸受体信号通路并非是砷剂诱导凋亡的惟一机制。抑制bcl-2基因bcl-2基因即细胞淋巴瘤/白血病-2基因是研究最早的与凋亡有关的基因69，是一种凋亡抑制基因，又称长寿基因，是维持癌细胞无限制生长的主要基因。bcl-2家族包括bcl-2、bax、bcl-x、bcl-w、bak、bad、a1、nr-13和mcl-1，其中bax、bak、bcl-xs是促凋亡因子，其余为抗凋亡因子。bcl-2对细胞周期无明显影响，而对细胞死亡的干扰有选择性，阻止了细胞死亡的最后途径，包括核苷酸内切酶对dna的降解。bax是bcl-2的一种同源蛋
11、白，bax既可以形成同聚体，又可与bcl-2形成异二聚体，bax蛋白与bcl-2蛋白的比值影响着细胞受到刺激后发生凋亡的比率。目前认为，bcl-家族促凋亡因子和抗凋亡因子的相对表达水平至少部分决定了细胞对凋亡信号的反应性。大量实验表明，bcl-2与bcl-xl能够抑制mpt开放和维持线粒体m，进而抑制cyto_c和aif从线粒体释放入胞浆并阻断了ros的生成，增加胞内gsh含量并促进其向核内转移，即有细胞内抗氧化作用。在砷剂诱导的nb4、u937及b细胞白血病细胞系lyh7细胞凋亡中bcl-2表达下调。在0mas2o3诱导nb4细胞凋亡时,cpp32(caspase3)被激活和降解parp，同
12、时bcl-2不仅在mrna水平而且在蛋白质水平均被下调；而在0mas2o3诱导恶性淋巴性白血病细胞凋亡过程中既无cpp32激活又无bcl-2调变，提示砷剂诱导的凋亡中bcl-2发挥的作用各异。有实验表明，mas2o3使肝癌细胞系hep201bcl-2表达明显下降，而凋亡的促进因子bax的表达明显增加，两种基因表达比例发生变化。又有报道，10mas2o3处理人肝癌qgy-7701、qgy-7703细胞48小时后其bcl-2基因表达明显下降，bax和fas基因表达明显增强，bax蛋白与bcl-2蛋白比值增加。对bax、bcl-xl等基因是否表达各报道不同1315。bcl-2的过度表达可抑制砷剂诱导
13、的凋亡相关现象，而通过反义技术使bcl-2下调可抑制细胞增殖及促进凋亡。综上所述，砷剂可通过对bcl-2基因的抑制诱导某些肿瘤细胞的凋亡。但as2o3并不影响恶性淋巴瘤细胞及某些成神经细胞瘤细胞系bcl-2(bcl-xl)的表达，提示bcl-2可能不是参与诱导以上细胞凋亡的主要中介。抑制nf-b的活化核转录因子nf-b(nuclearfactor-b)是1986年首先于b细胞中发现的一种结合于免疫球蛋白轻链增强子上的核蛋白。在正常情况下，nf-b与其抑制物ib结合，存在于细胞浆中，ib遮蔽着nk-b的基因定位序列(nls)，nf-b的生物学活性不表现出来。当细胞受到外界因素(包括细菌或病毒感染
14、、炎症细胞因子、tnf、lps、紫外线照射、电离辐射)等刺激时，ib将发生磷酸化并迅速降解，nf-b就被释放、激活并转入细胞核内调控一系列的基因表达。其中，nf-b在肿瘤细胞中发挥着重要的抗凋亡作用，因此，抑制肿瘤细胞nf-b的活性将引起肿瘤细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的生长。有研究表明，as2o3可强烈抑制htlv-1和htlv-2(humant-cellleukemiavirustype1,2)细胞的ib磷酸化，使nf-b不能进入细胞核中，即抑制了nf-bn的活化。启动子为nf-b依赖性的抗凋亡蛋白bcl-x1的表达也因此而下调。m下降及cyto-c的释放导致caspase-3激活，进而诱导了
15、htlv-1和htlv-2这两种对大多数凋亡诱导剂有抵抗作用的细胞发生凋亡。可见，抑制nf-b的活性也是砷剂诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一。使胞质ca2浓度升高zhang等发现以as2o3处理胃癌细胞系mgc803时，胞质ca2浓度升高与mgc803细胞凋亡呈平行关系，且两者对as2o3呈时间、剂量依赖性。推测砷可能通过以下机制改变胞质ca2浓度：(1)由于膜表面的bcl-2相关蛋白具有阳离子选择性通道的功能，bcl-2能在内质网、细胞核和线粒体水平影响ca2的亚细胞分布。因而，砷等凋亡信号对bcl-2的抑制作用使ca2通道开放，胞质ca2浓度升高；(2)细胞内ros活性升高及砷剂直接作用于细胞内钙离子转位酶的巯基均可使胞内外ca2平衡失控；(3)线粒体m下降使得ca2吸收逆转，导致ca2由线粒体转移至胞质。内质网及线粒体内ca2耗竭可直接或通过加强线粒体内氧化应激而导致细胞凋亡，而且，钙离子本身作为一种凋亡信号，可调节钙离子敏感的关键酶如
