《芹菜素对大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的保护作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《芹菜素对大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的保护作用（51页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、山西医科大学 硕士学位论文 芹菜素对大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的保护作用 姓名：史婷婷 申请学位级别：硕士 专业：药理学 指导教师：于肯明 2011-06-03 山西医科大学硕士学位论文 山西医科大学硕士学位论文 芹菜素对大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的保护作用 中 文 摘 要 芹菜素对大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的保护作用 中 文 摘 要 目的：目的：探讨黄酮类化合物芹菜素对大鼠实验性心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)时心肌细胞凋亡与 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 表达的影响，并分析其对心肌损伤的保护 作用。 方法方法：采用结扎左冠状动脉前降支，心肌
2、缺血45 min，再灌注2 h制作缺血再灌注模型。 将大鼠随机分为八组， 即正常组 （the normal group, Normal） 、 假手术组 （sham operation group, Sham） 、生理盐水缺血再灌注组(physiological saline ischemia-reperfusion group, NS)、溶剂 对照组(solvent control group, Sol)、美托洛尔对照组（metoprolol control group, Meto） 、芹菜 素低、中、高剂量（1 mgkg-1、2 mgkg-1、4 mgkg-1）用药组(apigenin lo
3、w, medium and high dose treatment group, Api1、Api2、Api4)。同时观察大鼠再灌注心律失常持续时间和再灌注 心律失常评分。再灌注2 h后，采用化学法测定一氧化氮(nitric oxide，NO)含量，用721分光 光度计测定一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)活力；用1%Evean Blue和2,3,5-三苯基 氯化四氮(2,3,5 tri phenyltetrazolium chloride, TTC)染色法测定心肌损伤面积和梗死面积； 采用TUNEL法检测原位标记凋亡心肌细胞； 免疫组化法测Bcl-2、 Ba
4、x和Caspase-3蛋白表达； 病理组织切片检查心肌损伤情况;采用RT-PCR法测Bcl-2和Bax基因的mRNA表达。 结果结果：芹菜素各剂量组血清样品中NO含量均显著高于NS组（P0.05）。芹菜素各 剂量组心肌细胞凋亡率明显低于NS组（P 0.05） .Myocardial cell apoptosis rate in apigenin groups with different dose were significantly lower than that of IV 山西医科大学硕士学位论文 山西医科大学硕士学位论文 V NS group (P 0.05） 。 （表1-1，附图1中
5、的图1-1） 表1-1不同剂量芹菜素预适应对缺血再灌注大鼠血清中NO含量的影响 组别 例数 样品管的OD值 sx 样品管的NO值 （ mol/L）sx Normal 8 0.0630.0014 65.4041.476 * Sham 8 0.0630.0013 65.4041.402 * NS 8 0.0160.0008 16.1400.859 Sol 8 0.0160.0007 16.1050.765 Api1 8 0.0210.0014 21.9301.550 * Api2 8 0.0320.0009 32.4561.035 * Api4 8 0.0450.0006 46.1050.692
6、* Meto 8 0.0450.0011 46.0881.160 * 注：*与生理盐水缺血再灌注比较 P0.05；标准管的OD值为0.020,空白管的OD值为0.01；标准管的浓度为20 mol/L 6 山西医科大学硕士学位论文 山西医科大学硕士学位论文 3 2 芹菜素药物预适应对缺血再灌注大鼠血清中一氧化氮合酶(nitric oxide synthase， NOS) 活力(分型)的影响 芹菜素低到高剂量组的心肌组织样品中TNOS活力 （0.3240.011） 、（0.4240.008） 、 （0.5140.005） U/mgprot显著高于NS组TNOS活力 （0.2150.008） U/m
7、gprot （P 0.05） 。 （表 1-3，附图1中的图1-3-1、图1-3-2和图1-3-3，附图2中的图1-3-4） 3.4 大鼠再灌注期心律失常评分和心律失常出现总持续时间。 NS 组、Sol组、Api1组、 Api2组、Api4组与Normal组、Sham组心律失常评分和心律 失常出现总持续时间比较均具有统计学意义（P 0.05） 。 7 山西医科大学硕士学位论文 山西医科大学硕士学位论文 （表1-4，附图1中的图1-4、图1-5） 表1-3 不同剂量芹菜素预适应对大鼠缺血再灌注心肌梗死面积的影响 组别 例数 IS（g） sx IS/AAR（%） sx Normal 8 0. 00
8、00.000 * 0.0000.000 * Sham 8 0. 0000.000 * 0.0000.000 * NS 8 0.2050.009 48.810.882 Sol 8 0.2040.011 48.840.850 Api1 8 0.1460.008 * 32.972.016 * Api2 8 0.0920.005 * 22.191.85 * Api4 8 0.0380.004 * 9.120.987 * Meto 8 0.0380.003 * 9.391.420 * 注：*与生理盐水缺血再灌注比较 P0.05。 表 1-4 芹菜素对再灌注心律失常持续时间和评分的影响(sx ) 组别 鼠
9、数 持续时间（s） 评分 Normal 8 0.000.00 0.000.00 Sham 8 3.941.91 0.330.52 NS 8 439.9579.87 * 4.170.75 * Sol 8 463.3081.22 * 4.330.52 * Api1 8 345.1446.03 * # 3.830.98 * # Api2 8 187.5741.37 * # 3.170.75 * # Api4 8 89.3718.37 * # 2.000.89 * # Meto 8 85.6216.92 * # 1.670.82 * # 注：与 Normal 组及 Sham 组比较，P0.05; 与
10、NS 组及 Sol 组比较，P0.05。 8 山西医科大学硕士学位论文 山西医科大学硕士学位论文 第二部分 芹菜素对大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡及相关蛋白 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 表达的影响 第二部分 芹菜素对大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡及相关蛋白 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 表达的影响 1 材料 1 材料 11 动物和分组 11 动物和分组 实验动物和分组同第一部分 12 仪器和相关试剂 12 仪器和相关试剂 电热恒温干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司。轮转式石蜡切片机：浙江金华益迪医 疗设备厂。BI-2000医学图像分析系统：成都泰盟科技有限公司。其他仪器同第
11、一部分。 细胞凋亡原位检测试剂盒( In Situ Cell Death Detection Kit , POD) 购自 Roche 公司， 兔抗鼠 Bcl-2 多克隆抗体、Caspase-3 多克隆抗体及 Bax 多克隆抗体均购自北京博奥森生 物技术有限公司。SP 试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。25 %乌拉坦（氨基甲酸乙 酯，上海润捷化学试剂公司） ；10 %中性福尔马林。3，3 一二氨基联苯胺(DAB)试剂盒： 北京中杉公司。其他试剂同第一部分。 2 方法 2 方法 211 在体大鼠心肌缺血再灌注模型的建立和芹菜素溶液的配制 模型的建立和芹菜素溶液的配制同第一部分 212 标本留取
12、 大鼠在体缺血再灌注实验结束时，快速取出心脏，置于O生理水中，洗净心腔残血， 标本剪取左冠状动脉前降支结扎线下约2 mm处左室前壁组织(约0.20.2 cm2大小)，经 10%甲醛溶液固定2448 h后，常规石蜡包埋，2 m切片 2.2 指标的测定 221 采用 HE 染色法检测芹菜素对在体大鼠心肌缺血再灌注后心肌组织病理学形态的影 响 HE 染色法具体操作步骤： 切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗:二甲苯(I)10 min二甲苯(II)10 min 二甲苯（）10 min 100%乙醇 2 min95%乙醇 2 min80%乙醇 2 min75%乙醇 2 min 蒸馏水洗 3 min.
13、PBS 洗 3 min3 次; 苏木素染色 3 min，自来水冲洗 3 min。 1%盐酸乙醇分化 30 sec，自来水冲洗 3 min。 1的稀氨水返蓝：30 sec，自来水冲洗 3 min。 置伊红染色：3 min，自来水冲洗 2 min。 常规脱水，透明，封片:75%乙醇(I)5 min85 %乙醇(II) 5 min95 %乙醇()5 min 100%乙醇(I)5 min二甲苯石碳酸 (3:l)10 min二甲苯(I)10 min二甲苯(II)l0 min 9 山西医科大学硕士学位论文 山西医科大学硕士学位论文 中性树脂封片。 制作好的心肌组织病理切片在光镜(40O)下观察. 222
14、采用原位末端标记法检测(terminal deoxynucleotide transferase mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)芹菜素对在体大鼠心肌缺血再灌注心肌细胞凋亡率的影响。 在细胞凋亡过程中，基因组 DNA 会断裂产生许多 DNA 断端，这些 DNA 链断端缺口 可以利用酶标记核苷酸 3末端以便识别。末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，TdT)可以将标记有荧光素的 ddUTP 转移到 DNA 片段的 3 -OH 游离末端，以此标记 DNA 链断端缺口 25。荧光素由结合有辣根过
15、氧化物(horseradish peroxidase,POD)的 Fab 段抗体识别。加入酶底物 DAB 显色后，制作好切片在光镜(40O) 下观察. TUNEL 法具体操作步骤： (l)石蜡切片，常规脱蜡至水:石蜡切片 2 m 置挂胶的载玻片上，58烤 15h，常规脱 蜡至水，二甲苯 I，二甲苯 II，二甲苯各 10 min，梯度酒精 100%， 100%，95%，90%， 80%，70%各 2 min，自来水洗 3 min; (2)3%H2O2:孵育 10 min，消除内源性过氧化物酶活性;PBS 洗 3 min3 次; (3)Proteinase K 20 g/ml 37 20 min，
16、PBS 洗 3 min3 次; (4)制备 TUNEL 反应混合液: 处理组用 50 l TdT+450 l 荧光素标记的 dUTP 液混匀放置在冰块上待用; 阴性对照组仅加 50 l 荧光素标记的 dUTP 液; 阳性对照组先加入 100 l DNase l，反应在室温 37 25 min，后面的步骤同处理 组; (5)加 50 l TUNEL 反应混合液(阴性对照组仅加 50 l 荧光素标记的 dUTP 液)于标 本上，37湿盒中孵育 60 min，室温放置 10 min。PBS 洗 3 min3 次; (6)50 l converter-POD 于标本上，加盖玻片或封口膜在 37暗湿盒中孵育 30 min， PBS 洗 3 min3 次; (7)DAB
