临床基因扩增检验实验室的设置、质量管理.

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1、临床基因扩增检验实验室的 设置、质量管理体系的建立 及其技术验收 云南省临床检验中心 杜廷义 2007，12，20 题外话： n不参加实习课？ n参加实习课？ 对相关管理文件的理解： n临床基因扩增检验实验室管理暂行办法 n临床基因扩增检验实验室基本设置标准 （第六条） n临床基因扩增检验实验室工作规范（第 十条、第十三条、第十四条） n临床实验室必须遵循的管理办法及其它 行业标准 强调： n污染的控制：预防为主 n质量保证 污染的途径： n实验材料 n试剂每一成分 n设备的每一部位 n每一操作步骤 污染的判断： n经验： 全阳性，CT值35；标准品的CT值发生波 动 阴性质控阳性 阳性率异常

2、增高 n轻微污染和非特异性扩增？ 污染和非特异性扩增: n目的基 因 n过程控 制 n反应体系（引物、模 版、酶、镁离子、退火、 循环） n条件优化 控制的手段： n工作区的严格划分 nSOP的制订和严格执行 n去污染措施的常规采用 污染的监测： n阴性质控的设置： 阴性血清样本 以水为模拟标本 仅含扩增反应液 （加鉴别实验室是否污染的空白管) 质控品的位置 标准品空白阳性质控阴性质控临床样 本 标准品空白阳性质控临床样本阴性质 控 实验室的设置 n管理要求：设置标准和工作规范 n具体落实：实事求是、因地制宜 设置标准和工作规范 “原则上分为四个分隔的工作区； 各区必 须有明确的标记” “每一

3、区域都须有专用的仪器；不同的工 作区应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服 ；离开工作区时，不得将各区特定的工作服带 出” “，可在开展临床标本检测前对提取方法 进行评价” “，本区如采用副压条件或减压情况下可 减少扩增产物从本区扩散至前区的可能性。 理想的设置 缓冲间缓冲间 扩增区试剂准备区样本制备区产物分析区 空气流向空气流向空气流向 缓冲间 专用走廊 工作流向 磁性连锁装置 现实的问题是： n建筑结构 n通道、门 n水电供应 n采光、通风 基本的要求: n四个区域必须是相互独立的 n各区的仪器设备及各种物品必须是专用 的 n各区间不能直通，应有缓冲间，供换工 作服及鞋子用 n产物分析区应

4、安装排风扇或其它抽风装 置。 扩增区 试剂准备区 样本制备区 产物检测区其它实验室 走 廊 实例： 其它实验室 样本制备区扩增区 试剂准备区产品检测区 走廊 实例： 实例： 产物检测区 扩增区样本制备区 其它实验室 休息区 试剂准备区 扩增 区 产物检测区 走廊 模板加样区 实例： 样本处理区 实例： 小结： n处理原则的核心是通过合理的设置 解决好临床PCR检测实际运作动态 过程中可能发生的污染的预防问题 n因此，实验室的设计必须充分考虑 到对污染来源和污染途径的预防和 控制 实验室各区的功能和配置： 试剂储存和准备区 n储存试剂的制备 n试剂的分装 n主反应混合液的制 备 n冰箱 n混匀器

5、 n微量加样器 n可移动紫外灯 n专用工作服和工作鞋 n消耗品（带滤心吸头、 离心管、一次性手套等 ） n专用办公用品等。 标本制备区： n临床标本的保 存 n核酸提取、储 存及其加入至 扩增反应管 n测定RNA时cDNA 的合成 n不得在本区对 样本进行PCR扩 增 n冰箱 (28和-20或-80) n高速台式冷冻离心机 n水浴箱和/或加热模块 n生物安全柜 n混匀器 n微量加样器 n可移动紫外灯 n专用工作服和工作鞋 n专用消耗品 n专用办公用品等 扩增区： nDNA 或cDNA扩增 n已制备的DNA模板和合 成的cDNA的加入 n主反应混合液制备成 反应混合液 n如果空间允许的话， 模板

6、的加入也可以在 一个独立的空间内完 成 n核酸扩增仪 n微量加样器(视情 况定) n可移动紫外灯 n专用工作服和工作 鞋 n专用消耗品 n专用办公用品等 产物分析区： n扩增片段的测定 n最主要的扩增产物 污染来源 n有可能使用致突变 和有毒物质 n微量加样器 n可移动紫外灯 n专用工作服和工作 鞋 n专用消耗品 n专用办公用品等 辅助用房： n清洁区 n标本接受区：灵活设置 不干扰四区 规范的保存和传递 实验室使用和管理： 标本接受区 样本制备区 扩增区 产物分析区 试剂准备区 区域的适当合并： “由于测定技术总是在发展之中， 区域的合并应根据仪器的特点而定” 小结： n从核心仪器特点、实验

7、室的现状出发， 综合考虑管理要求 n尽可能在现有条件下满足管理要求 n以管理措施弥补硬件的不足 n有条件，留有余地 n再好的分区设置，如果不辅之与认真执 行的相应的管理制度，等同于无。 实验室质量体系的建立： n管理要求 n体系建立 管理要求： 1 实验室设置和设备 1.1 实验室原则上应分为四个区，但如使 用全自动扩增检测仪，区域可适当合 并。 1.2 各工作区的明确标记 1.3 实验室设置应能有效地防止PCR后区产 物的污染。 管理要求： 2 设施和环境 2.1 实验室的设施、工作区域、能源、照明、 温控、通风等。应便于检测工作的正常进行 。 2.2 实验室应配备温度湿度计、稳压电源等。

8、2.3 进入和使用实验室各区域应有明确的限制和 控制。 2.4 应有实验室清洁、消毒制度及相应用具； 2.5 实验室应有有关生物污染物处理、生物防护 等措施及相应用具； 管理要求： 3 人员 3.1 实验室应配备足够数量的人员； 这些人 员必须经过培训，并取得上岗证； 3.2 实验室应有培训计划和措施，保证其技术 人员得到及时培训。 3.3 实验室应保存其技术人员有关资格证书 （如上岗证）、培训、技能和经历等技术档 案。 管理要求： 4 设备管理 4.1 主要设备应有维护程序文件及维护记录； 4.2 (a)有问题的设备应立即停止使用，并加上明显标识，如 可 能应将其贮存在规定的地方直至修复；(

9、b)修复的设备必 须 经校准、检定（验证）或检测满足要求后方能再次投入 使 用；(c)实验室应检查由于上述缺陷对以前所进行的检测 工 作的影响。 4.3 加样器、温度计、扩增仪和酶标仪等应有校准程序并进 行 校准，扩增仪和酶标仪应有明显的标识表明其校准状态 。 4.4 应保存扩增仪、酶标仪、生物安全柜、加样器等设备的 档 案 管理要求： 5 检测方法 5.1 实验室应制定：有关仪器设备操作程 序；有关扩增检测的工作程序。 5.2 所有上述标准操作程序都应现行有效并 便 于工作人员使用。 5.3 实验室应有仪器、试剂、消耗品的选购 、 验收、贮存和质检程序； 必须使用经 国 家有关部门批准的试剂

10、和仪器。 管理要求： 6 标本管理 6.1 实验室应建立对拟检测标本的唯一编号识别系统 。 6.2 实验室应制定有关标本收集、处理、运送、贮存 程序。 6.3 在接收标本时应有其状态的详细记录。 6.4 实验室应确定标本是否符合检测要求, 拒收标本 原因要明确。 6.5 如果标本必须在特定的环境条件下（如2-8、 -20和-70低温）贮存，则应对这些条件加以 维持、监控和记录； 管理要求： 7 记录 7.1 实验室应有适合自身实际情况又符合 现 行规章制度的记录管理制度； 7.2 记录应有参与标本收集、标本准备和 处 理、检测的人员签字。 7.3 所有记录和报告都应安全贮存、妥善 保 管并保密

11、。 管理要求： 8 报告 8.1 检测结果的报告应准确、清晰和客观。定性测定报告“阴 性”或“阳性”；定量测定则以拷贝数/ml或IU/ml报告。 8.2 每份报告应包括以下信息：（a）标题，例如“检测报告 ” （b）报告的唯一性标识（如序号）；（c）检测标本的特 性 和状态；（d）检测标本的接收时间和进行检测的时间； （f）采用的检测方法；（g）实验操作及校核人员的签字 ， 以及签发日期；（h）检测报告中应给出参考结果或范围 ； 8.3 当报告的有效性发生疑问时，实验室应立即通知临床相关 科室予以改正。 8.4 当临床科室或患者要求用电话、图文传真或其它电子和电 磁设备传送结果时，实验室应保证

12、工作人员遵循文件化的 程序，并为对方保密。 管理要求： 9 质量控制 9.1 实验室应有室内质量控制标准操作程 序 文件：（a）质控物的合理性； （b）质控方法（图）的有效性 ； （c）失控的判断； （d）失控的措施。 9.2 实验室应参加室间质量评价 管理要求： 10 抱怨 10.1 实验室应制定抱怨及其处理的标准操作程序； 应 将抱怨资料及处理抱怨所采取的措施及结果记 录 归档保存。 10.2 当抱怨或其它任何事项是对实验室是否符合其 现 行程序、或者是否符合临床基因扩增实验室 管 理暂行办法和临床基因扩增实验室工作规 范、或是对其它有关实验室校准或检测质量 提 出疑问时，则实验室应立即对

13、这些范围的工作 和 有关职责进行审核。 管理要求（现场考核）： n送审的文件描述与实验室实际情况的一 致性 n实际运行与文件规定的一致性 n人员素质：对文件的认知、熟悉、灵活 运用程度 现场考核的实际内涵： n认识到不到位 n落实到不到位 n符合性检查加指导性检查 n有重点的全面检查 建立质量管理体系首先要解决的问题： n第一个问题：质量体系建立的核心问题 是什么？ n第二个问题：质量体系模式要达到的管 理目的是什么？ n第三个问题：达到目的的方法（途径、 手段）是什么？ 质量体系的定义 为实施质量管理所需的组织结 构、程序、过程和资源。 n要点：定义涵盖了实验室管理的每一个 方面。 n组织结

14、构：一个组织为行使其职能，按某 种方式建立的职责、权限及其相互关系。 n程序：为进行某项活动所规定的途径。 n过程：将输入转化为输出的一组彼此相关 的资源和活动。 四个组成部分的关系： n关键：核心过程（活动） 纽带程序 组织结构 程序 资源 过程 理解 n“过程”的重要性 1、工作是通过过程来完成的。 2、质量管理是通过对各种过程的控 制 来实现的。 3、质量管理本身也是一系列的过程 n过程的分解、控制 n过程的有机组合 过程 前处理 检测 样本采集 和接受 编制报告 审核 报告发放 记录保存 登记 编号 质控 咨询 质量体系运行的目的 方针 目标 质量环 及要素 QS 结构 QS 文件 Q

15、S 运行 QS审核 QS评审 质量改进 报告 证书 主要手段：质量体系文件 n质量方针： n质量手册：阐明实验室的质量方针，各 方面质量管理的一般性描述 n程序性文件：对通用于整个实验室的某 些方面工作的文件化描述 n标准操作程序（SOP文件）：是实验室 最为具体、最具有可操作性、也是使用 频率最高的文件 PCR实验室技术验收对文件的要求： n仪器设备的维护保养程序； n仪器设备的校准程序； n仪器设备的操作程序； n临床标本的收集程序； n临床标本的处理（核酸纯化）程序； n临床标本的保存程序； n核酸扩增及产物分析检测的操作程序； n试剂的质检操作程序； n实验室消耗品购买、验收和贮存程序

16、； n实验室废弃物的处理程序； n实验室的清洁程序； n室内质量控制程序； n抱怨处理程序。 n申请表的附录5“需准备的标准操作程序（ 最低要求）” n对实验室的质量手册和程序文件没作要求 n对必须具备的SOP文件的编撰格式没作具体 要求 SOP：实验室最具个性的文件 n不够严谨准确 n不够连贯 n不够严密 例： n用加样枪取100l样品加入提取液 n用加样器（移液器）以前进式移液法吸 取100l样品加入提取液 例： 向一新的经高压灭菌处理过的0.5ml离心管中加 入10l充分混匀的RNA提取液A（RNA提取液A易沉淀 ，取样前需用移液器反复吸打混匀后吸取）。加人 50l血清标本或阴阳性标准品，再加人200l的 RNA提取液B充分混匀。室温放置5分钟。6000rpm离 心1分钟，小心吸去上清，用75的预冷乙醇（DEPC 水配制）洗沉淀两次。（取75乙醇450l洗沉淀 ，充分震荡混匀，6000rpm，离心1分钟，然后去上