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1、实验九 微生物鉴定中常用的生理生化实验 一、实验目的 1.证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同,从而说 明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解实验的原理和方法。 3.了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和 方法。 二、实验材料 1.菌种 枯草芽孢杆菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,普通 变形杆菌,产气肠杆菌。 2.培养基 固体淀粉培养基,明胶培养基试管,尿素琼脂试管,醋酸铅培养基 ,葡萄糖蛋白胨水培养基,柠檬酸盐斜面培养基。 3.溶液和试剂 革兰氏染色用卢戈氏碘液,甲基红指示剂。 三、实验原理 1.蛋白质水解试验: 微生物
2、对大分子物质如淀粉不能直接利用,必须依靠产生的 胞外酶将大分子物质分解后,才能被微生物吸收利用。 胞外酶主要为水解酶,裂解大分子为较小化合物,使其能被 运输至细胞内。 如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖,这过程可 通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。 淀粉遇碘液会产生蓝色,在细菌水 解淀粉的区域,用碘液测定时不再 产生蓝色,表明细菌产生淀粉酶。 2.明胶液化试验: 明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质,在25以下可维持凝胶状 态,以固体形式存在,而在25以上明胶会液化。 有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶,水解这种蛋白质,而 使明胶液化,甚至在4仍能保持液化状态。 尿素是由大多数哺乳
3、动物消化蛋白质分泌在尿液中 的废物,尿素酶能分解尿素释放出氨,这是一个分辨细 菌很有用的诊断试验。 尽管许多微生物都可以产生尿素酶,但它们利用尿 素的速度比变形杆菌属的细菌要慢,因此,尿素酶试验 被用来从其他非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分这个 属的成员。 尿素琼脂含有尿素葡萄糖和酚红,酚红在pH6.8时为黄色, 而在培养过程中,产生尿素酶的细菌将分解尿素产生氨,使培养 基的pH升高,在pH升至8.4时,指示剂就转变为深粉红色。 3.尿素试验: 4.硫化氢试验: 硫化氢试验是检测硫化氢的产生,也是用于肠道细菌检查常 用生化试验。 有些细菌能分解含硫的有机物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨 酸等产生硫
4、化氢,硫化氢一遇培养基中铅盐或铁盐等,就形成黑 色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。 5.甲基红试验: 甲基红试验是用来检测葡萄糖产生的有机酸,如甲酸、乙酸、乳酸 等。当细菌代谢糖产生酸时,培养基就会变酸,使加入培养基中的甲基红 指示剂由橙黄色(pH6.3)转变为红色(pH4.2),即甲基红反应。 尽管所有的肠道微生物都能发酵葡糖产生有机酸,但这个试验在区分 大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的。 这两个细菌在培养的早期均产生有机酸,但大肠杆菌在培养后期仍能 维持酸性pH4,而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物,如乙醇、 丙酮酸等,使pH升至大约6。因此大肠杆菌为阳性,产气肠杆菌为阴性。 6.柠檬
5、酸盐试验: 柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸是否被利用。 有些细菌利用柠檬酸盐作为碳源;而另一些细菌不能利用柠 檬酸盐,如产气肠杆菌。 细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后,产生碱性化合 物,使培养基的pH升高,当加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时,培养 基就会由绿色转变为深蓝色。 溴麝香草酚蓝指示范围为:pH小于6.0时呈黄色,pH在 6.57.0时为绿色,pH大于7.6时呈蓝色。 三、实验步骤 (一)、淀粉水解实验 1. 将固体淀粉培养基熔化后冷却至50C左右,无菌操作制成平 板。 2. 用记号笔在平板底部划成4部分。 3 . 将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌 分别在不同的部
6、分划线接种,在平板的反面分别在4部分写上菌 名。 4 . 将平板倒置在37C温箱中培养24小时。 5 . 观察各种细菌的生长情况,打开平板盖子,滴入少量卢戈氏碘 液于平板中,轻轻旋转平板,使碘液均匀铺满整个平板。 淀粉水解试验 (二)、明胶水解实验 1. 取3支明胶培养基试管,用记号笔标明各管欲接种的菌名。 2. 用接种针分别穿刺接种枯草芽孢杆菌,大肠杆菌和金黄色葡萄 球菌。 3.将接种后的试管置于20度中培养35天。 4.观察明胶液化情况。 穿刺接种 1)手持试管。 2)旋松棉塞。 3)右手拿接种针在火焰上将针 端灼烧灭菌接着把在穿刺中可能伸入 试管的其他部位,也灼烧灭菌; 4)用右手的小指
7、和手掌边拔出 棉塞。接种针先在培养基部分冷却, 再用接种针的针尖沾取少量菌种。 5)将接种过的试管直立于试管 架上,放在37或28恒温箱中培 养。24h后观察结果 注意:若具有运动能力的细菌, 它能沿着接种线向外运动而弥散, 故 形成的穿刺线较粗而散、反之则 细而密。 (三)、尿素实验 1.取2支尿素培养基斜面试管,用记号笔标明各管欲接种的菌名。 2. 分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。 3.将接种后的试管置于35C中培养2428小时。 4. 观察培养基颜色变化。 (四)、硫化氢试验 1.用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培 养基中。 2.置于37度培养48小时后,观察有
8、无黑色硫化铅的产生。 (五)、甲基红试验 1.将上述两菌分别接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基中。 2.置于37度培养48小时后,将1支培养基内加入甲基红试剂2滴, 培养基变为红色者为阳性,变为黄色者为阴性。 (六)、柠檬酸盐试验 1.将上述两菌分别接入2支柠檬酸盐斜面培养基中。 2.置于37度培养48小时后,观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细 菌生长和是否变色,蓝色为阳性,绿色为阴性。 问题?问题? 淀粉是逐级水解的,淀粉初步水解产物是麦芽糖,麦芽糖继续水解则水解为 葡萄糖。 淀粉水解是生成葡萄糖的:(C6H10O5)n+nH2O=nC6H12O6 葡萄糖(C6H12O6)是多羟基醛,可用醛的性质进行
9、检验,如银镜试验,有银 白色物质生成;斐林实验,有砖红色沉淀生成.。 1.不利用碘液,怎样证明淀粉水解的存在? 如果不用碘液鉴定淀粉的存在,可以使用斐林试剂来鉴定是否生成了还原性 糖,麦芽糖和葡萄糖都是还原性糖,淀粉则是非还原性糖. 新配的斐林试剂加入到盛有还原性糖溶液的试管中,混合均匀后, 将试管在沸水浴条件下加热1-2min,就会出现砖红色沉淀. 如果试管中淀粉没有水解,因为淀粉为非还原性糖,将斐林试剂加入后,水浴加 热不会出现砖红色; 如果试管中淀粉水解了,无论是初步水解还是彻底水解,都会产生还原性糖( 麦芽糖和葡萄糖都是还原性糖),还原性糖可以与斐林试剂反应,水浴加热后,出 现砖红色沉
10、淀. 2.为什么大肠杆菌在甲基红反应中为阳性,而产气肠杆菌为阴性? 这个试验与伏普试验最初底物和最终产物有何异同? 大肠杆菌和产气肠杆菌都属于肠道微生物,所有肠道微生物都能够利用葡萄糖作 为其能量来源,但是它们的代谢途径不同,因而所产生的产物不相同。 大肠杆菌利用葡糖糖发酵,主要产生混合有机酸,比如乳酸,乙酸和甲酸等,使培养 基pH下降(至4左右);产气肠杆菌利用葡萄糖进行发酵,主要产生乙醇,3-羟基丁 醇和少量有机酸,培养基pH下降不很明显(6.5左右)。 甲基红的变色范围为pH4.2(红)6.3(黄)。 大肠杆菌分解葡萄糖产生有机酸,培养液由原来的橘红色变成红色,因此反应为 阳性;同理,产气肠杆菌为阴性。 V-P实验用于证明在糖代谢过程中,分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸通过缩合和 脱羧生成3-羟基丁酮,之后被还原成2,3-丁二醇。 3-羟基丁酮在碱性条件下,可被空气中的氧气氧化成二乙酰,二乙酰 与培养基里蛋白胨中的胍基作用,生成红色化合物,即伏普反应阳性 ;不产生红色化合物为反应阴性。(详细反应过程见P118。) 参考: 微生物学实验;百度百科; 百度知道;百度图片 特此感谢!