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1、细胞凋亡细胞凋亡CellularApoptosis一、概论随着生物学研究的深入，生物学家越来越意识到细胞死亡，特别是细胞凋亡具有特殊的生物学意义，对于一个多细胞生物来说，要维持完整性和保持平衡性，凋亡是一个非常重要的生物学过程。多细胞生物的诞生、生长、发育、存活以及死亡，无一不伴随着细胞凋亡过程。细胞死亡是组织病理学的中心议题，细胞死亡现象也是生命新陈代谢的固有本质。例如胚胎发育(embryonicdevelopment)正常组织更新（Normaltissueturnover），以及在增殖淋巴细胞群体中选择适当的克隆（selectionofappropriateclones），这种细胞生理性死
2、亡是种系发育史中早就存在的，有利于动物发育中的许多生命功能。1972年Keer根据细胞发生了与坏死完全不一样的死亡过程而提出了细胞凋亡（Apoptosis）的概念。80年代末，细胞凋亡成为新的医学研究热点。正是由于发现了细胞凋亡的规律，三位科学家获得了2002年的诺贝尔医学或生理学奖。他们是英国的西德尼布伦纳、美国的H罗伯特霍维茨和英国的约翰E苏尔斯顿。二、凋亡概念：细胞凋亡是细胞循自身程序结束其生命的主动死亡的过程，具有特征的形态和生化改变，是由基因控制的个别细胞发生的自主有序的死亡。即是由基因控制细胞有目的，有选择性的自我消亡过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础。三、凋亡的形态特征凋亡发
3、生的过程表现为细胞死亡（dyingprocess）和被清除(eliminationprocess)（细胞缩小致密染色质边集核碎片凋亡小体）1、丧失了特殊的表面结构（微绒毛等）和接触区，形成光滑的轮廓，从周围活细胞中分离出来；2、细胞缩小：胞浆细胞器集中（squeeze）胞膜出芽或起泡（bleb）细胞皱缩（shrinkage）；3、保持胞浆细胞器完整性扫描电镜下，细胞表面呈奇特火山口样外观，线粒体不肿胀，内膜不破裂；短暂滑面内质网（SEN）扩张，扩张间隙与细胞表面融合；有时有聚积排例的半结晶状核糖体；可有与细胞表面平行的微丝束。4、形成调亡小体（Apoptoticbodies）由凋亡细胞裂解为若
4、干个由质膜包绕的小体，每个凋亡小体有自己的一簇细胞器。周围不引起炎症反应。5、核内染色质结构改变（这是最引人注意的改变）染色质（chromatin）凝集于核膜下表现为：核质固缩（condenation）；边集（margination）；核浆紧实（compaction）；核膜皱折（fold）。HE1000，小鼠凋亡肝细胞HE1000，小鼠凋亡肝细胞在透射电镜下，染色质浓缩在一起呈颗粒状，半月形磨茹，或完整的捻珠形；核孔集中于少数区域，浓缩的染色质并不贴附在核膜上；转录复合物从核仁中脱落到核浆中呈一簇嗜锇酸小体。残留的核仁蛋白核心移到周围染色质特征性部位。核扭曲，断裂呈若干片断，所有片断开始时均有
5、质膜包绕。6、凋亡细胞、凋亡小体被识别与吞噬：凋亡细胞或凋亡小体迅速被吞噬同质或异质细胞吞噬体（phagosome）进一步变性溶酶体残留小体（lysosomalresidualbodies）偶尔凋亡小体逃避被吞噬，如凋亡的导管上皮掉入管腔。几点说明：1、形态学改变告诉我们凋亡细胞发生早期细胞体积缩小（凋亡增加凋亡能干预肿瘤的发生与发展，许多肿瘤凋亡指数（ApoptoticindexAI）与肿瘤进展、预后有关。如：基底细胞癌（baselcellcarcinoma）就癌细胞来说其异型性和分化程度应为高度恶性的肿瘤，但其生物学行为为低度恶性表现，仅为局部浸润很少转移。研究发现该肿瘤中细胞凋亡明显，这
6、对降低肿瘤浸润与转移有一定关系。乳腺癌：作为激素控制的靶器官，乳腺细胞凋亡受激素控制，细胞凋亡调控异常是乳癌发生的原因之一。ERPR（+）的乳腺癌抗雌激素治疗或卵巢切除去势疗法能使瘤细胞发生凋亡。BCl-2阳性乳癌，产生耐药主要是抑制化疗药物阿霉素诱发细胞凋亡的作用。前列腺癌是男性常见肿瘤，随着前列腺特异性抗原（prostaticspecificantigen）的应用，新发现的前列腺癌急剧增多。雄激素依赖型前列腺癌(AndrogendrpendentprostaticcarcinomaADPC)BCl-2（）时，性腺切除、雄激素拮抗剂的治疗有效，其机制是对雄激素敏感的癌细胞在缺乏雄激素后凋亡。
7、雄激素非依赖型前列腺癌（AndrogenIndependentprostaticcarcinomaAIPC）BCl-2（+）时，治疗效果差。转移性前列腺癌70%病人只有短暂疗效，3年内复发转变为AIPC，新研究发现抗寄生虫药“苏拉明（suramin）可诱导AIPC中癌细胞凋亡。膀胱癌也是一种常见肿瘤，复发率高，10-25%浸润，预后差。研究结果显示，从正常移行上皮演变为级、级的膀胱癌时BCl-2表达明显低于级膀胱癌，提示BCl-2可能在肿瘤进展和转移中起一定作用。小细胞肺癌BCl-2、BCl-XL表达为主；而非小细胞肺癌以BCl-XL为主，BCl-I基因家族表达的失衡对肺癌细胞凋亡有重要作用。
8、总之增加癌细胞的凋亡能干扰肿瘤的生物学过程。（二）肿瘤细胞凋亡与基因调控根据调控基因功能分为两大类，这两类基因相互作决定细胞的生死命运。细胞增殖抑制基因p35、p53、RB、DOC（与粘附分子类似基因）、WT-11、促进细胞凋亡的基因（wimlstumortype-1）、DAD1、等自杀基因（suicidalgene）凋亡蛋白，凋亡基因细胞凋亡促进基因（APO-1Fas、TGF-、SP2、Bax、c-rel、Bel-XS、Bak）2抑制细胞凋亡的基因促进细胞增殖的基因（c-myc、c-eld1、ras、v-src）（生长基因抗凋亡基因）抑制细胞凋亡的基因（Bcl-2、EIB、LMW-5-HL、
9、C-Kit、Bel-XL）（三）凋亡相关基因有三类：1、细胞凋亡过程表达的基因，多数抑癌基因；2、促细胞凋亡基因，多数抑癌基因；3、抑制细胞凋亡基因，多数癌基因。凋亡与细胞增殖有许多潜在的联系。从细胞形态学上看，细胞凋亡与有丝分裂的超微结构事件，如核膜消失、染色体凝集、细胞膜内陷等有许多共同之处；从分子水平上看，有许多原癌基因和抑癌基因与细胞增殖和凋亡有关，它们通过各自的通道参与细胞凋亡的调控，研究较多的基因有BCL2、Caspase家族、IAP家族、Fas、P53、Cmyc等。1.Bcl-2家族Bcl-2家族包含一组相关蛋白，它们分别与Bcl-2在4个保守区具有同源结构域(BH1-4)，并以
10、此作为结构基础，形成同源性或异源性二聚体，通过蛋白蛋白之间的相互作用，调节细胞的凋亡，在细胞凋亡途径的上游远端，构成一个重要的细胞内凋亡调控点。（1）Bcl-2家族的组成细胞内Bax高表达时，细胞对死亡信号敏感，加速细胞凋亡，当Bcl-2高表达，Bcl-2可与Bax形成异源性二聚体，抑制细胞凋亡。所以Bcl-2Bax的比例对决定细胞凋亡的敏感性起重要作用，抑制凋亡因子促进凋亡因子的总比率，最终决定细胞的的生存或死亡。（4）Bcl-2在肿瘤中的表达与肿瘤的发生：Bcl-2在多种肿瘤中的表达已得到证实。一般来说，Bcl-2阳性的肿瘤要比Bcl-2阴性的肿瘤预后差。在一些比较常见的恶性肿瘤中，Bcl
11、-2表达经常阳性的有：慢性淋巴细胞白血病、慢性髓白血病伴有原始细胞危象者和急性髓白血病几乎l00阳性，滤泡淋巴瘤80阳性，T、B非霍奇金淋巴瘤65阳性，霍奇金淋巴瘤40阳性，乳腺癌80阳性，神经母细胞瘤40阳性，鼻咽癌80阳性，前列腺癌75阳性，肺鳞癌25阳性，肺腺癌10-15阳性。在85的滤泡型恶性淋巴瘤，存在t(14；18)(q32；q21)。这一染色体易位使位于14号染色体长臂的免疫球蛋白重链基因和位于18号染色体的bcl2基因的转录活性位点拼接，造成bcl2基因的过度表达，使B淋巴细胞免予凋亡而长期存活，并可能附加其他基因的突变而发展成淋巴瘤。Bcl-2的免疫染色最常用于区别反应性滤泡
12、性淋巴瘤。在甲状腺中，Bcl-2抗体还不能用于区别桥本甲状腺炎和低分化MALT淋巴瘤。Bcl-2Follicularlymphoma(Bcl-2immunostaining)Follicularlymphoma:Bcl-2反应性增生淋巴结Bcl-2免疫染色在生发中心Bcl-2阳性:如何判断同时做CD3免疫染色证实为生发中心T细胞浸润2.Caspase家族Caspase家族是一组蛋白酶，介导即将死亡的细胞高效而特异的蛋白水解作用，是细胞凋亡的执行者。Caspase蛋白水解酶有2个特征：、都是半胱氨酸蛋白酶；、作用部位都在天冬氨酸残基后的位点.Caspase家族功能凋亡其它caspase-4(TX
13、ICH-2ICEref-)炎症caspase-5(TYICEref-)炎症caspase-13(ERICE)mcaspase-11(ICH-3)mcaspase-12炎症caspase-1(ICE)炎症caspase-14(MICE)caspase-3(CPP32apopainYama)效应者酶caspase-7(Mch3ICE-LAP3CMH-1)效应者酶caspase-6(Mch2)效应者酶caspase-8(MACHFLICEMch5)启动者酶caspase-10(Mch4)启动者酶caspase-2(ICH-1mNedd2)启动者酶caspase-9(ICE-LAP6Mch6)启动者酶
14、CED3Caspase家族的组成至今已发现有14种Caspase，分为3组。1、Caspase-2，-8，-9，是细胞凋亡的起始Caspase，2、Caspase-3，-6，-7，执行细胞凋亡，是效应Caspase。这两组Caspase在细胞凋亡中缺一不可。3、由Caspase-1，-4，-5组成，与细胞凋亡的关系不是很密切，可能与多种炎症因子的成熟有关。(2)Caspase的活化途径Caspase家族的蛋白都是以非活性的酶原方式存在于胞质中，当它们通过一定的途径被活化后，依据一定的顺序，裂解一些重要的蛋白底物，导致相应底物的活化或灭活，最后可能需通过信号转导途径，产生凋亡细胞的一系列的形态和
15、生物化学的改变。3.IAP家族IAP家族是抑制细胞凋亡作用的一组蛋白。在人类已确认有6种IAP相关蛋白(NAIP、c-IAP1hIAP-2、c-IAP2hIAP-1、XIAPhICP、Survivin和BRUCE)，有研究表明，以上蛋白的过表达，都可以不同程度地抑制多种因素如TNFR、Fas受体介导的、柔红霉素、VP16诱导的以及去除生长因子后所引起细胞凋亡。有研究表明在酵母和哺乳动物细胞中，IAP家族蛋白抑制caspase的活性，抑制细胞凋亡，作用强度为XIAPc-IAP2c-IAPlSurvivin。5种IAP在人体内的不同组织中分布不同。XIAP分布较广，除外周血的白细胞以外，成人或胚胎
16、的其他组织中均有表达；clAPl、cIAP2在肾、小肠、肝、肺和神经系统（低级）表达较高。NAIP在成人肝、胎盘中有所表达，脑中亦有微量表达，RTPCR方法可检测到。Survivin在正常细胞中，除了正在分裂的细胞之外，它在成熟的终末分化组织中基本无表达，而在胚胎发育过程中和人的部分肿瘤组织中表达，是一个新的肿瘤标记，有报道说，Survivin与肿瘤细胞的抗药性、肿瘤转移过程中的血管生成以及某些肿瘤如神经母细胞瘤等的预后不良有关。4、Fas：也称为APO-1（CD95），是1989年两家实验室同时发现在细胞株表面介导凋亡的蛋白分子，属于NTFR（肿瘤坏死因子受体）和NGFR（N生长因子受体）家族，分子量45000，细胞膜抗原，能抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡，许多耐药与复发的肿瘤中CD95和Fasl突变，尤其在淋巴瘤、白血病和肠癌病人中常有FasAPO-1的表达，对预后有一定影响。Fasl为T淋巴细胞上Fas的天然配基（ligant），Fasl与表达F
