腺苷的细胞保护和细胞毒性作用

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1、广州医学院 硕士学位论文 腺苷的细胞保护和细胞毒性作用 姓名：李舒珏 申请学位级别：硕士 专业：病理学与病理生理学 指导教师：刘金保 20100601 广州医学院硕士学位论文 腺苷的细胞保护和细胞毒性作用 1 腺苷的细胞保护和细胞毒性作用 硕士研究生： 李舒珏 导 师： 刘金保 教授 中文摘要 背景与目的 腺苷是一种遍布于机体细胞内的内源性核苷，它既是 ATP 的代谢产物，又 是合成 ATP 的前体物质。机体氧含量正常时，腺苷保持低水平释放；而氧供给 失衡时，腺苷释放量可大量增加。腺苷在临床上的应用十分广泛，它已经被用于 治疗包括心律失常、急性心肌梗死、肺部炎症、神经源性疼痛、各种缺血再灌注

2、损伤在内的多种疾病，其中腺苷在心脏疾病治疗中的应用最为成熟。目前人们对 腺苷的研究多集中在腺苷激活细胞表面的腺苷受体之后产生的效应， 我们将这一 机制称为受体机制（间接作用） 。腺苷受体分为 A1，A2a，A2b，A3四个亚型，均 为具有 7 个跨膜域的 G- 蛋白偶联蛋白家族，不同亚型的受体介导产生不同的生 理和病理学效应。 现有的绝大部分临床使用腺苷的理论基础都与腺苷受体的介导 密不可分。腺苷还可以直接转运进入细胞后产生各种效应，我们称这一机制为非 受体机制（直接作用）。目前为止有许多对腺苷双向性作用的研究和报道，但是 其作用机理尚不清楚。本实验旨在从腺苷对细胞活力、增殖和死亡的影响以及腺

3、 苷对蛋白酶体抑制剂诱导细胞死亡敏感性的影响两个方面探讨腺苷的双向作用 及其机理。 实验方法 1. 调控细胞内 ATP 水平 1.1 基础 ATP 水平的调控 无糖/右旋葡萄糖培养基 1.2 下调细胞内 ATP 水平 广州医学院硕士学位论文 腺苷的细胞保护和细胞毒性作用 2 （1）寡霉素（oligomycin）抑制细胞的有氧氧化 （2）2- 脱氧葡萄糖（2- DG）抑制细胞的糖酵解 （3）双嘧达莫（DP）抑制细胞向胞内转运腺苷 2. 细胞内 ATP 水平检测 （1）HPLC （2）荧光素酶发光法 ATP 检测试剂盒 3. 细胞死亡检测 （1）Annexin V- FITC- PI 流式细胞术

4、（2）荧光显微镜活细胞动态监测系统 （3）Western blotting 检测 PARP 蛋白的降解 4. 细胞活力和增殖检测 （1）Alamar blue 法 （2）MTT 法 （3）细胞计数仪 5. 检测相关蛋白变化情况 Western blotting 实验结果 1. 腺苷的细胞保护和细胞毒性双向作用 1.1 ATP 前体物质腺苷增加各种细胞内 ATP 含量 分别在右旋葡萄糖培养基和无糖培养基中培养各种细胞株，给予腺苷处理 后，应用高效液相色谱法 HPLC 检测细胞内相对 ATP 浓度，结果显示 Ade 都能 够在不同程度上提高细胞内 ATP 水平。 1.2 腺苷降低各种细胞的活力 在

5、右旋葡萄糖培养基中培养各种常见细胞株，给予不同浓度的腺苷（0.5- 5mM） ，作用 72 小时后，应用 MTT 法检测细胞活力，结果显示腺苷能够剂量依 赖性降低细胞的活力。 1.3 腺苷对细胞死亡的影响 1.3.1 腺苷诱导 Ana- 1 细胞凋亡 广州医学院硕士学位论文 腺苷的细胞保护和细胞毒性作用 3 正常培养条件下生长状态良好的 Ana- 1 细胞，按对照、Ade0.5、1、2、4、 8mM 分组处理 12 小时，应用 Annexin- V- FITC- PI 流式细胞术检测，结果显示腺 苷能够剂量依赖性诱导 Ana- 1 细胞凋亡。 1.3.2 腺苷导致 PARP 蛋白的降解 正常培

6、养条件下生长状态良好的 Ana- 1 细胞，按对照、Ade0.5、0.8、1、2、 4mM 分组处理 6 小时，应用 western blotting方法检测 PARP 蛋白激活降解情况， 结果显示腺苷能够剂量依赖性增加 Ana- 1 内 PARP 蛋白的降解，诱导细胞凋亡。 上述结果说明腺苷具有细胞毒性作用。 1.4 改变 ATP 水平对腺苷致细胞活力和增殖的影响 1.4.1 细胞内 ATP 低于生理浓度时腺苷增强细胞活力和增殖 K562 细胞培养于无糖、血清浓度 1%的培养基中，细胞内 ATP 水平低于生 理浓度，给予不同浓度的腺苷（0- 8mM）处理 48 小时，应用 alamarblu

7、e 试剂检 测，结果显示腺苷能明显增强 k562 细胞的活力和增殖。 K562 细胞培养于无糖培养基中，细胞内 ATP 低于生理浓度，给予不同浓度 的腺苷（0.125- 2mM） ，作用 48 上时，应用细胞计数仪进行细胞计数，结果显示 腺苷能促进 k562 细胞增殖。 1.4.2 腺苷抑制 k562 细胞的活力和增殖 K562 细胞培养于无糖、血清浓度 10%培养基中，或培养于含有 2g/L 右旋葡 萄糖、血清浓度为 1%或 10%的培养基中，细胞内 ATP 接近或达到生理浓度，给 予不同浓度的腺苷（0- 8mM）48 小时，应用 Alamar blue 试剂检测，结果显示腺 苷能减弱 k5

8、62 细胞的活力和增殖。 K562 细胞培养于含有 2g/L右旋葡萄糖的培养基中，处于生理 ATP 浓度下， 给予不同浓度的腺苷（0.125- 2mM）作用 48 小时，应用细胞计数仪进行细胞计 数，结果显示腺苷能抑制 k562 细胞增殖。 上述结果说明以细胞内 ATP 生理浓度为界，腺苷双向影响细胞的活力和增 殖：当细胞内 ATP 水平低于生理浓度时，腺苷产生细胞保护作用；当细胞处于 生理 ATP 浓度下，腺苷表现为细胞毒性作用。 1.5 耗竭细胞内 ATP 对腺苷致细胞死亡的影响 K562 细胞培养于无糖培养基中，按对照、Ade (2mM)、olig (0.5g/ml)、Ade 广州医学院

9、硕士学位论文 腺苷的细胞保护和细胞毒性作用 4 +olig 分组处理 18 小时，应用流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果显示寡霉素能 够耗竭细胞内ATP而导致细胞大量凋亡， 与对照组比较具有统计学差异， P0.05； 同时给予 2mM 腺苷能够明显逆转寡霉素导致的细胞死亡，与寡霉素组比较具有 统计学差异，P0.05。 1.6 双嘧达莫（DP）拮抗腺苷的细胞保护和细胞毒性作用 1.6.1 拮抗增殖抑制作用 K562 细胞培养于含有 2g/L右旋葡萄糖、 血清浓度 10%的培养基中， 按对照、 Ade (2mM)、DP (5M) 和 Ade +DP 分组处理 24 小时，应用细胞计数仪进行细 胞计数

10、， 结果显示腺苷能够抑制 k562 细胞的增殖， 差异具有统计学意义， P0.05； 双嘧达莫能够部分拮抗腺苷的这一作用， 与 Ade 组比较具有统计学差异， P0.05。 1.6.2 拮抗细胞保护作用 K562 细胞培养于无糖培养基中，按对照、Ade (2mM)、DP (5M)、olig (0.5g/ml)、Ade +olig 组和 olig +Ade +DP 组处理 18 小时，应用流式细胞术检测 细胞凋亡情况，结果显示寡霉素导致大量 k562 细胞死亡，同时给予腺苷能够提 高细胞的存活率， 差异具有统计学意义，P0.05；双嘧达莫能够拮抗腺苷的细 胞保护作用，与 olig +Ade 组比

11、较差异具有统计学意义，P0.05。 1.6.3 拮抗增加 ATP 的作用 K562 细胞培养于无糖培养基中，按对照、Ade (2mM)、DP (5M)、olig (0.5g/ml)、Ade +olig 组和 olig +Ade +DP 组处理 3 小时，应用荧光素酶发光法 检测细胞内 ATP 水平，结果显示寡霉素使细胞内 ATP 含量减少，同时给予腺苷 处理可将细胞内 ATP 水平恢复，而双嘧达莫几乎能够完全逆转腺苷所增加的 ATP，使细胞内 ATP 回到与 olig组同一水平。 2. 腺苷对蛋白酶体抑制剂诱导细胞死亡的敏感性的影响 2.1 腺苷提高蛋白酶体抑制剂（PI）诱导细胞死亡的敏感性

12、2.1.1 提高细胞死亡敏感性- 流式细胞术 K562 细胞培养于含有 2g/L右旋葡萄糖的培养基中， 按对照、 MG132 (5M)、 Ade (0.1、 0.5、 2mM)、 MG132 (0h) +Ade (0.1、 0.5、 2mM)、 MG132 (6h) +Ade (0.1、 0.5、 2mM)分组处理 15h， 应用 AnnexinV- FITC- PI 流式细胞术检测细胞凋亡情况， 得如下结果： （1）低浓度的腺苷（0.1mM、0.5mM）可以剂量依赖性增加 MG132 广州医学院硕士学位论文 腺苷的细胞保护和细胞毒性作用 5 诱导的 k562 细胞死亡。腺苷与 MG132 同

13、时处理时可分别使细胞死亡率增加 3.55%和 8.35%，后者差异具有统计学意义，P0.05；在 MG132 作用 6 小时之后 给予腺苷处理分别使细胞死亡增加了 11.45%、18.1%，差异具有统计学意义， P0.05；同一浓度的腺苷，在 6 小时后给予所产生的增敏程度高于同时给予所产 生的增敏程度，前者导致的细胞死亡率分别比后者增加了 7.9%和 9.75%。 （2） 在 MG132 作用 6 小时之后给予高浓度的腺苷（2mM）处理，能够增加 MG132 诱导产生的细胞死亡，细胞死亡率增加了 23.2%，差异具有统计学意义， P0.05； 2mM 腺苷与 MG132 同时处理时逆转 MG

14、132 的细胞毒作用，使细胞死亡率降低 了 14.55%。 2.1.2 提高死亡敏感性- 细胞形态学 K562 细胞培养于含有 2g/L右旋葡萄糖的培养基中， 按对照、 MG132 (5M)、 MG132 (0h) +Ade (0.1、0.5、2mM)、MG132 (6h) +Ade(0.1、0.5、2mM)分组处理 后加入碘化吡啶(PI)染液，应用荧光倒置显微镜进行细胞形态学动态监测，共记 录 24 小时。以 15 小时照片为例，得到如下结果： （1）低浓度的腺苷（0.1mM、 0.5mM）可以增加 MG132 诱导的 k562 细胞死亡。腺苷与 MG132 同时处理时在 形态学上表现为细胞

15、死亡的轻微增加；MG132 作用 6 小时之后给予腺苷处理则 表现为形态学上细胞死亡明显加重，PI 荧光增多增强。 （2）在 MG132 作用 6 小 时之后给予 2mM 腺苷处理，推动细胞形态在 MG132 组的基础上更进一步向死 亡方向改变，明显提高了 MG132 诱导细胞死亡的敏感性；2mM 腺苷与 MG132 同时处理时逆转 MG132 诱导细胞产生的形态学上死亡改变，形态学照片与对照 组相似；（3） MG132 作用 6 小时之后给予腺苷处理， 腺苷剂量依赖性加重 MG132 诱导产生的细胞死亡。 以上结果显示当细胞内 ATP 水平处于生理浓度下，相对低浓度腺苷处理能 够提高蛋白酶体

16、抑制剂诱导细胞死亡的敏感性。 2.2 低能量状态下腺苷提高蛋白酶体抑制剂（PI）诱导细胞死亡的敏感性 2.2.1 腺苷死亡敏感性- 流式细胞术 K562 细胞培养于无糖培养基中， 处于低能量状态， 按对照、 MG132 (5 M)、 Ade (0.1、0.5、2mM)、MG132 (0h) +Ade (0.1、0.5、2mM)分组，处理 12 小时后， 应用 AnnexinV- FITC- PI 流式细胞术检测细胞凋亡情况，得出如下结果：腺苷能 广州医学院硕士学位论文 腺苷的细胞保护和细胞毒性作用 6 够剂量依赖性增加 MG132 诱导产生的 k562 细胞死亡，各组间差异具有统计学 意义，P0.05。 2.2.2 提高死亡敏感性- 细胞形态学 K562 细胞培养于无糖培养基中，处于低能量状态，按对照、MG132 (5 M)、 Ade (0.1、0.5、2mM)、MG132 (0h) +Ade(