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1、繁殖技术2 0 0 6 - - 2 0 0 7 年全国养羊生产与学术研讨会议论文集 8 l 羊活体采卵技术研究进展 邵庆勇“2 ，洪琼花1 ，成文敏2 ( 1 云南省畜牧兽医科学研究所，昆明 6 5 0 2 2 4 ；2 中国农业大学动物科技学院，北京1 0 0 0 9 4 ) 摘要：随着羊胚胎生物技术的发展，尤其是胚胎体外生产、转基因的研究，科研生产中对卵母细胞的需求 越来越大传统的从屠宰场卵巢获得卵母细胞有许多不足，因此，发展活体采卵技术显得迫切。国内有 关羊活体采卵的报道较少，文章介绍了羊活体采卵方法的基础分析影响活体采卵效率的各种因素。 前言 随着畜牧业和动物生物技术的不断发展对遗传
2、基因明确的胚胎和卵母细胞的需求量增大，通过超数 排卵虽可获得比自然发情状态下多的胚胎，但超排效 果不稳定，不能预知供体对超排的反应，无法完全掌握 其规律，所以胚胎来源问题是限制胚胎移植最终效率 和实际应用的重要问题( H a r e s i g n ，1 9 9 2 ；胡明信， 2 0 0 1 ) 。取自屠宰后的卵巢卵母细胞，虽经济方便，但 往往存在供体系谱、健康状况记录不全，供体羊种用价 值不了解和不能重复利用等缺点因此，如何获取数量 较多、遗传背景清楚的卵母细胞已成为胚胎生物技术 进一步发展的关键 活体采卵( O v u mP i c k - u p ，O P u ) 是继体外受精 ( I
3、 V F ) 、胚胎移植( E T ) 之后的又一项胚胎工程技术对 遗传品质优秀的母羊进行激素处理后，活体抽吸卵巢 上卵泡中的卵母细胞，通过体外受精、体外培养和冷冻 保存技术在体外获得优质胚胎，是一种廉价高教的胚 胎生产技术，0 P u 技术结合I V P 、E T 等技术后不仅 可反复从良种动物体内采集卵母细胞生产胚胎，提高 母畜繁殖效能，还可缩短世代问隔，加速育种进程，具 有胚胎生产成本低、效率高等特点。由于对供体母畜 的生产和繁殖性能无不良影响而越来越受到人们的重 视，将逐步成为今后良种胚胎生产的主要方向。如果 在山羊的育种过程中，对早期发育阶段的良种羊采用 无损伤的活体采卵和胚胎体外生
4、产技术相结合，优质 卵子资源将得到充分利用，良种的世代间隔可缩短到 原来的三分之一，将大大加快育种进程( T e r v i te ta l ， 1 9 9 6 ) 1 羊活体采集卵母细胞的方法 活体采集卵母细胞( o o c y t er e c o v e r yf r o ml i v ed o - n o r s ) ，又简称0 P U ( O v u mP i c k U P ) 技术，可分为超声 波法、内窥镜法及手术法。家畜活体采集卵母细胞的 技术最初是沿用医学上为解决妇女不孕症中的一种医 疗技术，即利用腹腔镜采得卵母细胞后，经I V M F C 获得可用胚胎，移植到母体子宫内达到
5、妊娠生育的目 的。对于有特殊价值的个体和在某些特定领域，活体 采卵具有重要意义对于大家畜，超声波诱导采卵具有 简单、无不良伤害、可重复、高效率等特点而较多应用； 对于小反刍动物而言，手术法或腔镜法似乎是从活体 采集卵母细胞唯一可行的方法( O a l l ie ta 1 2 0 0 1 ) 胚胎体外生产技术在生产中的实际应用很大程度 上依赖于对具有高遗传价值家畜高教、稳定、可重复的 活体采卵技术的发展，活体采卵技术在牛上的应用已 较为广泛，而在羊上的应用则较受限制( G a l l ie ta l ， 2 0 0 1 ) 1 9 7 4 年S n y d e r 和D u k e l o w
6、首次进行了羊的 活体采卵，他们利用腹腔镜从绵羊的2 1 个卵泡抽吸到 6 个卵母细胞，由于当时胚胎体外生产技术尚未成熟， 使得活体采卵技术的潜力未被充分认识近年来随着 山羊胚胎生物技术的发展，尤其是胚胎体外生产，转基 因和克隆技术的发展，对卵母细胞的需求量越来越大， O P u 技术也得到了快速发展( T e r v i te ta l ，1 9 9 2 ；B a l d a s s a r r ee ta 1 1 9 9 4 a ；E a r le ta l ，1 9 9 7 ，S t a n g le ta l ， 1 9 9 9 ) 羊的活体采卵方法主要有超声波引导卵泡抽 吸法、腹腔内窥
7、镜采卵法及手术法。 1 1 超声波引导采卵 超声波引导通过阴道采卵( T r a n s v a g i n a lu l t r a s o n n d - g u i d e do o c y t ea s p i r a t i o n ，T U G A ) 在牛等大家 畜活体采卵中的应用较为成熟，但在羊上的应用较少， T U G A 的原理是利用不同组织，如体液、脂肪和肌肉 等对高频率声波吸收和反射能力的不同，在荧屏上显 示这些不同组织横截面的图像。例如卵巢上的黄体及 卵巢实质等较硬的组织反射声波的能力较强，在荧屏 上产生出明亮的图像；而含有卵泡液的卵泡吸收声波 的能力较强反射声波的能
8、力较弱，在荧屏上显示出较 暗的图像。T U G A 法采卵需要超声波仪、阴道探头、 真空泵、采卵针和导管等设备，实际操作中探头和采卵 针及导管可连接在一起而方便操作( 朱化彬等，1 9 9 8 ) 据G r a f f ( 1 9 9 5 ，1 9 9 9 ) 报道，T u G A 的操作程序大 致为：供体羊禁食3 6 小时以上，采卵前将供体羊麻醉 后腹部朝上保定于专用保定架，头部朝上倾斜4 5 。，让 8 2 中国草食动物 2 0 0 7 年专辑 会阴部处于适宜的工作高度，先用手排空直肠，然后对 肛门、会阴及尾根区剃毛，清洗、消毒；把用频率为5 M H z ，波长为2 8 0m m 的人用阴
9、道扇形探头连接超声 波主机。操作者戴上乳胶手套后把左手的中指和食指 插入直肠后探查子宫韧带，找到卵巢后，用手指把卵巢 拉近腹壁后段通过食指把卵巢固定于直肠与腹壁之 间，然后调整真空泵压力，把长度为2 8c m 的1 7 号采 卵针及B 超探头插入阴道，用右手固定住后观察监视 器进行抽卵( 详见图1 ) 。 图1山羊超声波阴道法采卵时手 及探针放置图( G r a f te ta l ，1 9 9 9 ) G r a f t 等( 1 9 9 9 ) 报道采用T u G A 法卵母细胞回收 率达6 l 6 8 2 ，该法需要有较熟练的操作经验和 技巧，但该法只适用于2 0 3 0k g 重的供体
10、大于3 0 k g 重的供体由于阴道较长、腹部较大而难以固定卵 巢。C a r t e r j a 等( 2 0 0 2 ) 报道超声波法抽吸卵泡后卵母 细胞的回收率在6 0 8 0 之间，对羊进行T U G A 的缺点主要是很难通过直肠把握法固定卵巢，导致超 声波不能观测到卵巢的某些部分，使得卵巢上的部分 卵泡未能检测到；由于对卵巢的固定困难，就很难准确 刺破卵泡并抽吸卵母细胞，使得部分可用卵泡没法抽 吸；T U G A 法还容易导致那些直径较大且壁薄的卵泡 在抽吸之前被挤破，因此，中等大小且发育整齐的卵泡 有利于T U G A 法回收。 1 2 腹腔内窥镜采卵法 腹腔镜采卵法( L a p
11、 a r o s c o p l cF o l l i c u l a rA s p i r a t i o n ，L F A ) 也叫腹腔镜活体采卵( L a p a r o s c o p i co v u m p i c k u p ，L O P U ) 、腹腔镜卵细胞回收( L a p a r o s c o p i c0 一 o c y t eC o l l e c t i o n ，L 0 c ) 简称内窥镜法( E n d o s c o p y ) ( A n e le ta t ，1 9 9 7 ，S t a n g e ta t ，1 9 9 9 ；L u t h e re
12、 ta t ， 2 0 0 2 ；) 。 L O P U 法采集卵母细胞过程为：供体山羊禁食1 2 2 4 小时后被控制在标准的腹腔镜台上，给予全身麻 醉，母羊头朝下倒置仰卧保定后，在乳房下1 5c m 2 0 c m 范围期毛、消毒后把手术架倾斜3 0 4 5 ，在乳房前 3 5c m 处腹壁的左右侧切开2 3 个直径1 5c m 左 右的小口，插人腹腔镜、操作杆和采卵针( 采卵针连接 采卵管后和真空泵相连) ，在腹腔镜的观察下通过操作 杆和针头的配合将抽吸卵泡中的卵母细胞。当有经验 的操作者进行抽吸时，根据被抽吸的卵泡数量，每只母 羊的操作时间为1 0 2 0 分钟，在2 3 小时内可采集
13、 1 0 0 枚以上的卵母细胞( G r a f te ta I ，1 9 9 5 ；S t a n g le ta l ， 1 9 9 9 ) 。 内窥镜法与手术法相比降低了繁殖器官的粘连， 可重复性高可减少供体的应激，但需要昂贵的设备， 对采卵人员的技术熟练度要求较高。不同研究者采用 内窥镜法采卵，C O C 回收率差别较大，T e r v i t 等 ( 1 9 9 2 ，1 9 9 3 ，1 9 9 5 ) 、S m i t h 等( 1 9 9 4 ) 采用内窥镜法回 收羊卵巢C O C ，回收率平均达5 0 ，回收的C O C 可 用率达8 8 ；G r a f t 等( 1 9
14、9 9 ) 回收率为6 8 3 7 1 5 蹦；B a l d a s s a r r e 等( 1 9 9 4 a ，1 9 9 4 b ，2 0 0 2 ) 采用内窥 镜法采卵，回收率平均达8 0 ，回收的卵母细胞( 1 2 级) 可用率仅为4 9 8 ；L u t h e r 等( 2 0 0 2 ) 报道羔羊和 成年羊回收率分别为5 3 和4 1 无显著性差异- 大 部分研究者也得到相同的结果。S t a n g l 等( 1 9 9 9 ) 1 周 1 2 次采卵回收率为5 1 “6 2 “，采用P M S G 处理 后较不进行激素处理有较高的回收率，并报道回收的 c O c 有6
15、5 7 0 适合进行I V P 。 1 3 手术法活体采卵 在无法进行超声波法或内窥镜法采卵的情况下， 手术法活体采卵( L a p a r o t o m yo o f c y t e sr e c o v e r y ) 因简 单，不需要复杂设备而具有一定优势。手术法采卵前 供体羊应禁食1 2 2 4 小时，供体羊仰卧固定于手术架 上，四肢固定。每公斤体重注射0 0 2 o 0 4m l2 静 桧灵麻醉后，手术部位一般选择乳房前腹中线部( 在两 条乳静脉之间) 或腹中线的两侧，去毛消毒后盖上刨 巾，使预定的切口暴露在创巾开口的中部，避开较大血 管和神经，切开皮肤后钝性分离肌肉，剪开腹膜后用
16、食 指和中指拉出子宫和卵巢，记录两侧卵巢卵泡数后直 接用含有抽卵液的1 0m l 注射器抽卵( P t a ke ta l ， 1 9 9 9 a ，1 9 9 9 b ；邵庆勇等，2 0 0 3 ) ，在抽吸卵泡的过程中 需用生理盐水冲洗卵巢。手术法采卵对卵巢的观察比 较直观，固定卵巢较容易，整个采卵过程只需5 l O 分 钟，卵母细胞回收率稳定，技术性要求较低，回收率可 稳定在6 5 以上，G r a f t 等( 2 0 0 0 ) 手术法采卵回收率 达6 9 8 ，P t a k 等( 1 9 9 9 a ) 对4 5 周龄和3 6 岁绵 羊手术法活体采卵，卵母细胞回收率分别为8 8 2 和 8 3 3 ，二者间无显著性差异。 2 影响羊活体采卵效率的因素分析 活体采卵最终回收的适宜I V M 的A 、B 级卵母细 胞数受卵巢可用卵泡( 2r a m ) 数、卵母细胞回收卒， 繁殖技术 2 0
