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1、应用-淀粉蛋白和D-半乳糖建立阿尔茨海默病动物模型的研究 作者：刘小莉，陈虹，王明远，景富春，郑秋生，王振华【摘要】 目的应用D-半乳糖（D-galactose）及A2535联合建立阿尔茨海默病大鼠模型。方法通过对Wistar大鼠应用腹腔注射D-半乳糖42 d，第29天应用脑立体定位仪海马内注射A2535，制成阿尔茨海默病动物模型，第43 天利用Morris水迷宫进行行为学检测并检测脑匀浆超氧化歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量变化。结果与对照组相比，模型组大鼠水迷宫行为学检测潜伏期明显增高，脑组织SOD含量减少，MDA含量增加。结论应用D-半乳糖及A2535可建立阿尔茨海默病模型。 【
2、关键词】 阿尔茨海默病； D-半乳糖； A2535 ； Morris水迷宫； 超氧化歧化酶； 丙二醛 ； 大鼠模型Abstract：ObjectiveTo establish the models of Alzheimers Disease by injection of D-galactose and A2535. MethodsD-galactose was injected intraperitoneally in Wistar rats for 42 days and after 29 days aggregated A2535 was injected into the right
3、hippocampus of rats.Behavior was tested by Morris water maze, SOD and MDA in the brain were also examined. ResultsCompared with control group, the learning and memory ability was decreased in model rats. The activity of SOD decreased and the content of MDA increased. Conclusion Injection of A2535 an
4、d D-galactose may cause Alzheimers Disease.Key words：Alzheimers Disease; D-galactose; A2535; Morris water maze; SOD; MDA; Rat models 阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)又称老年痴呆，是以进行性认知障碍和学习记忆力损害为主的中枢神经系统退行性病变。显著的病理特征是海马和大脑皮层等部位出现老年斑（Senile plague,SP）和神经元纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs) 1。随着人口老龄化时代的到来，AD的
5、发病率越来越高，预计2025年全球受该病困扰的人数将达到1 400万，在西方国家，成为继心血管疾病、癌症、中风之后的第四大死亡原因，我国每年有近百万痴呆新发病例。老年痴呆将对社会经济发展和老年卫生保健带来巨大的挑战，AD的研究防治将对提高老年人的生活质量具有举足轻重的意义2，3。 在实验研究中，建立动物模型颇受关注，探索理想的动物模型对于明确病因、发病机制及治疗药物研发等方面均起到关键的作用。本实验采用腹腔注射D-半乳糖及海马内注射A2535联合建立动物AD模型，通过行为学筛选及脑匀浆检测分析比较模型动物与正常对照动物脑内超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的变化情况。1 器材与方法1.
6、1 动物及分组健康Wistar大鼠，雄性，体重在（18020）g左右，室温2023，湿度50%70饲养，自由进水、饮食与采光。1.2 试剂A2535（Sigma公司），SOD测试盒(南京建成生物工程研究所)，MDA测试盒(南京建成生物工程研究所)，D-半乳糖(BBI公司)等。1.3 仪器脑立体定位仪（美国BAS公司，型号：SAS-4100型），牙科钻（韩国STRONG型），酶标仪（美国BIO-RAD 公司，型号：Model 680），Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所，型号：SMG-2），离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：GL-20G-H），电热恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司，
7、型号：DHP-9162）及相关手术器械等。1.4 方法1.4.1 A2535的孵育A2535用无菌生理盐水配成2 g/L，-20保存，使用前在37保温箱中放置7 d，使其变成凝聚态4。1.4.2 药物注射每天上午10：00给模型组大鼠腹腔注射D-半乳糖，100 mg/kg，1次/d，共计42 d。正常对照组注射等量生理盐水。第29天用2.5戊巴比妥钠按50 mgkg-1体重腹腔注射将大鼠麻醉后固定于脑立体定位仪，用硫化钡将大鼠颅顶脱毛固定：脱毛后将大鼠固定在立体定位仪上，门齿棒固定于水平零点以下(3.30.4)mm，常规切开大鼠颅顶皮肤并暴露颅骨，以前囟为基点，参照Daxion和Watson脑
8、立体定位图谱定位海马，用微量进样针注射5 l A2535，在5 min之内注射完毕并留针5 min。缝合头皮，腹腔注射庆大霉素作预防性抗感染处理。1.5 Morris水迷宫行为学检测用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力。实验历时5 d，平台放置在第一象限，以第三象限正中为入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的路线圈及所需时间潜伏期5。1.6 脑匀浆检测1.6.1 脑匀浆的制备将大鼠用2.5%戊巴比妥钠麻醉后放置冰台上迅速断头取脑，在冰生理盐水中清除血液、滤纸拭干、称重，加生理盐水制成10脑匀浆，用低速离心机14 520 g，离心8 min，取上清液进行检测。1.6.
9、2 酶标仪检测SOD和MDA按照试剂盒说明要求进行检测。1.7 统计分析结果均以 s表示，采用SPSS12.0统计分析软件分析，以P<0.05表示均数间比较具有统计学意义。2 结果2.1 Morris水迷宫检测结果结果见（图1，表1）。图1所示为Wistar大鼠在Morris水迷宫中游泳的轨迹路线图。表1 Morris水迷宫行为学检测潜伏期结果(略) 由表1可知，模型组大鼠较正常组大鼠潜伏期延长，反映了造模后大鼠学习记忆能力下降。2.2 脑匀浆SOD及MDA含量检测结果见表2。表2 脑匀浆SOD及MDA含量检测结果(略) 由表2可知，模型组大鼠较正常组大鼠SOD含量下降，而MDA含量升高
10、。3 讨论 由于阿尔茨海默病多发生在65岁以上老年人，其发病与机体的衰老状态密切相关。-淀粉蛋白为老年斑的主要成分，在AD的致病发展中发挥着关键的作用，为各种原因诱发AD的最终通路。给予外源性-淀粉蛋白导致AD必须保证其为聚集态，只有聚集态的A才能发挥细胞毒性作用。A可能通过两种方式引起氧化应激：一是A在本身的某个氨基酸上形成自由基，然后这些自由基被传递到膜上；二是A结合到神经元细胞和胶质细胞膜上晚期糖基化终末产物的受体（RAGE）上后触发自由基产生，而阻断RAGE可抑制自由基生成和A聚集6。D-半乳糖代谢产物半乳糖醇，不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀，功能障碍
11、和代谢紊乱，动物的行动迟缓，学习记忆能力下降7。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，SOD活力的高低与衰老等有着密切联系。MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度。本实验通过海马内注射A联合腹腔注射D-半乳糖模拟了AD学习记忆能力下降，脑匀浆SOD活力下降而MDA含量上升，造成大鼠亚急性衰老状态，并且模型稳定，为后续的药物筛选研究及其他研究打下了良好的基础。【参考文献】 1David M.Armstrong,Roxamme Sheffield,Amanda JMishizen-Eberz,et al.Plasticity of Glutamate and GABAA Recepto
12、rs in the Hippocampus of Patients with Alzheimers diseaseJ.Cellular and Molecular Neurobiology,2002,23(4/5):491.2Dineley KT,Westerman M,Bui D,et alBeta-amyloid activates the mitogen-activated protein kinase cascADe via hippocampal alphanicotinic acetylcholine receptors:In vitro and in vivo mechanism
13、s relateated to Alzheimers diseaseJ.J Neurosci,2001,21(12):4125.3仇成轩,施侣元.进一步重视我国老年痴呆流行病学研究J.中华流行病学杂志,2005,26(12):931.4沈玉先,杨军,魏伟,等.-淀粉样多肽2535片段诱导的大鼠学习记忆功能障碍J.中国药理学通报,2001,17（1）：26.5Zheng Feng,Yong Cheng ,Jun-Tian Zhang.Long-term effects of melation or 17 on improving spatial memory performance in cognitively impaired ovariectomized adult ratsJ.Journal of Pineal Research.2004,37:198.6楚晋,叶翠飞,李林.二苯乙烯苷对痴呆小鼠学习记忆及自由基代谢的影响J.中国康复理论与实践，2003，9（11）：643.7刘新宇,何绪屏,陈连剑,等.蛇床子素在老年性痴呆模型大鼠血浆的药代动力学研究J.中国医药导报，2006，3（24）：17.
