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1、复旦大学 硕士学位论文 水稻花发育相关MADS-box基因功能的转基因分析 姓名：陈锐 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：曹凯鸣 20020601 复旦大学硕士学位论文 摘要 一组具有M A D s b o x 结构域的转录因子在控制花器官的诱导与发育中起着重 要作用。本文以水稻广陆矮4 号( O r y z as a t i v a , L S s p I n d i c aV a r i e t y G u a n g L u A iN o 4 ) 幼穗总R N A 为模板，根据M A D s b o x 保守区的序列设计简并 性引物，利用3 R A C E 的方法
2、获得了6 条新的水稻花发育相关M A D S b o x 基因， 分别命名为F D R 心D S 3 - 8 , 并利用5 R A C E 的方法获得了该6 条基因完整的c D N A 序列，包括完整的编码区，5 - U T R 和3 - U T R 。该6 条基因编码的蛋白质都具有 典型的雌D s b o x 结构域，其与水稻中其它家族成员的M A D s b o x 结构域同源性高 达9 0 以上，且除F D R M A D S 5 外均具有半保守的K 区，这说明它们都是典型的 麟- b o x 基因。对于花器官特异性表达的F D P A I A D S 3 和F D R M A D S
3、6 ，为了更清楚地 了解它们在花器官发育中所扮演的角色。我们对之进行了转基因研究。 复旦大学硕士学位论文 A b s t r a c t A g r o u po fr e g u l a t o r yf a c t o r sc o n t a i n i n gt h eM A D S - b O Xd o m a i ni sp l a y i n ga n i m p o r t a n tr o l ei nc o n t r o l l i n gf l o r a lo r g a ni n d u c t i o na n dd e v e l o p m e n t I n
4、t h i ss t u d y , u s i n g a st e m p l a t et h et o t a lR N Af r o m y o u n gi n f l o r e s c e n c eo f r i c eG u a n g - L u - A iN o 4 a n daM A D S b o x d e g e n e r a t ep r i m e r , w ei s o l a t e da n dc h a r a c t e r i z e d6f I l l l 1 e n g t hn e w r i c ef l o w e r i n g
5、- r e l a t e dM A D S - b o xg e n ec D N A s n a m e dF D R M A D S 3 8r e s p e c t i v e l y , u s i n gt h e3 - R A C Ea n d5 一R A C Em e t h o d o l o g y P r o t e i n se n c o d e db yt h e s e6g e n e s c o n t a i nat y p i c a lM A D S b o xd o m a i nt h a ts h o w sm o r et h a n9 0 i d
6、 e n t i t yt ot h a to f t h e o t h e rr i c eM A D S - b O X p r o t e i n s a n das e m i c o n s e r v a t i v eK - b o x f e x c e p t f o r F D R M A D S S ) w h i c hm e a n st h a t F D R 凇D s 3 8a r et y p i c a lM A D S b o xg e n e s I n o r d e rt ou n d e r s t a n dm o r ec l e a r l
7、yt l l er o l e st h a tt l l e s t r i c t l yi n f l o r e s c e n c e s p e c i f i c F D R M A D s 3a n dF D R M A D s 6p l a yi nr i c ef l o w e r d e v e l o p m e 啦w eb u i I tu p t r a n s f o r m e dp l a n t sc a r r y i n gt h e s eg e n e s 2 复旦大学硕士学位论文 综述：花发育模型的发展及对M A D S b o x 基 因的研究
8、进展 一、花发育的模型 1 花发育的经典模型 B c 模拟 高等植物生活史中最重要的一个阶段就是植物的生殖过程，这不仅是植物 繁殖后代和种群扩散的手段和基础，同时也是农业生产获得产品的关键时期。植 物生殖过程中的一个重要的功能器官就是花器官，花器宫的正常发育对植物繁 衍、种群扩散和农业生产都有着不言而喻的重要意义。近年来，随着分子生物学 技术的飞速发展，对花器官发育的研究也越来越深入，有关花器官发育的特异性 基因研究已取得了突破性的进展。这主要体现在通过对双子叶植物拟南芥和金鱼 草的花同源异形突变体的研究确定的花发育的A B C 模型上。 植物所有的地上部分( 苗除外) 都是源自茎的顶端分生组
9、织，而这些分生 组织是一组正在分裂尚未分化的细胞。在植物的生长过程中，这些组织中的小部 分从顶端分生组织中分离出来，根据植物的不同生长阶段形成不同类型的原基和 分生组织。以模式植物拟南芥为例，在营养生长期，枝的顶端分生组织产生叶原 基，最后发育成叶；在生殖生长期，通过花诱导，枝的顶端分生组织转化成花序 分生组织，在其侧翼形成螺旋状的花原基，每个花原基以确定的时空模式依次产 生一系列的花器官原基。这些花器官原基的细胞以四轮同心的方式分裂分化成不 同的器官，最终形成一朵完整的花：( 由外向内) 四个萼片，四个花瓣，六个雄 蕊，两个融合的心皮。那麽这些花器官原基的命运到底是如何被决定的呢? B o
10、w m a n ，C o e n 以及M e y e r o w i t z 等人在1 9 9 1 年提出了至今为止仍被广泛接受的 花发育的A B C 模型“7 。“。A B C 模型认为：控制花器官特征的基因按功能可划分为 A B C 三大类：A 组基因控制第1 、2 轮花器官的发育，其功能丧失会使第l 轮萼片 变成心皮，第2 轮花瓣变成雄蕊；B 组基因控制第2 、3 轮花器官发育，其功能 丧失会使第2 轮花瓣变成萼片，第3 轮雄蕊变成心皮；C 组基因控制第3 、4 轮 花器官发育，其功能丧失会使第3 轮雄蕊变成花瓣，第4 轮心皮变成萼片。即同 一组基因控隶H 相邻两轮花器官的发育，花的每一
11、轮被1 组( 第l 、4 轮) 或相邻 2 组( 第2 、3 轮) 基因控制。也就是说，花的4 轮结构花萼、花瓣、雄蕊和心 复旦大学颈士学位论文 皮分别由A 、A B 、B C 和C 组基因决定( 图1 ) 。这模型还指出：( 1 ) A 、C 组基因 是互相抑制的，c 组基因不能在A 组基因控制范围内表达，即A 抑制C 在第1 、2 轮中的表达；反之亦然。( 2 ) B 组基因的表达同A 组、C 组基因表达是独立的。 而对A B C 模型理论的验证又是建立在对一系列同源异形基因的克隆和分析的基 础之上的，这些同源异形基因大都具有一个保守的结构域叫A D S b o x 。 M A D S -
12、 b o x 结构域是一个保守的形成二聚体结合D N A 区，存在于不同物种的转录 因子中，它的得名源自不同物种中首先发现的四个家族成员的首字母：M C M l ( m f n i e h r o m o s o m em a i n t e n a n c eg e n e 酵母微染色体维持基因) ，刀E 4 棚坶 ( a g 狮o u sg e n eo fA r a b i d o p s i s 拟南芥轮生器官确定性基因) ，D E F I C E N S ( d e H c i e n sg e n eo ，A n t i r r h i n u mm a j u s , 金鱼草轮生
13、器官确定性基因) ，以及 S R F ( s e ，u mr e s p o n s ef a c t o r 鲫B 人血清应激因子基因) “1 。近年来的研究 表明，在被子植物中，大多数M A D S b o x 基因参与花发育的不同阶段，相互之间 可能形成复杂复合物并构成复杂的网络来决定花原基和器宫的特征以及调节花 发育的整个过程。 萼片花瓣雄蕊心皮 图1 花发育A B C 模型 在拟南芥中，属于A 组的是A P E T A L A l ( 爿用) 和A P E T A L A 2 ( A P 2 ) ，B 组是 A P E T A L A 3 ( A P 3 ) 和P I S T I L
14、 L A T A ( P I ) ，C 组是A G A M O U S ( 彳o ( 见图2 ) 。“，其 中除彤外，均属于M A D S b o x 基因家族。拟南芥3 组5 个基因中任何一个基因 功能缺失或突变，就会导致花器官性状的改变。如a g 和a p 2 突变体表型改变是 相反的：在a p 2 突变体中，花被器官被生殖器官所代替；而在a g 突变体中，生 殖器官被花被器官所替代。在A B C 三组功能基因都缺失的三突变体中，所有花 器官都表现为叶片的特征。同样对金鱼草的研究也表明其花发育与拟南芥有极其 相似的遗传机制。拟南芥中的M A D S b o x 基因，在金鱼草中总能找到相对
15、应的同 源基因及突变表型，而且A B C 模型对其也同样适用。如S Q U A M O S A ( S Q U A ) 对应 A P l 。，D E F I C I E N S ( 矗对应爿彤，6 L O B O S A ( 钇伪对应用，P L E N A ( P L E ) 对应爿p 1 。目前，在其它植物中也不断克隆了爿用，A P 3 , P f 和彳占的同源基因， 而且通过异位表达或表达反义R N A 等实验证实它们在功能上是保守的。例如，在 烟草中异位表达来源不同的彳占同源基因B A G I ( 来自油菜”“) ，P M A D S 3 ( 来自矮 复旦大学硕士学位论文 牵牛3 ) ，
16、O S I 。4 D S 3 ( 来自水稻“”) 和P L E ( 来自金鱼草“”) 都能产生相似的突变 表型。在转基因的烟草中组成型表达蜊卯发现，第一轮花器官由萼片变成了心 皮，第二轮花器官F h 花瓣变成了雄蕊，尽管这些雄蕊无法产生花粉。这些表型的 改变证明了c 组基因的表达对A 组基因有抑制作用。在转入水稻O S M A D S 3 的转基 因烟草中也发现萼片和花瓣形态的改变以及可育性的下降。在拟南芥a p 3 突变体 中异位表达金鱼草的彪E 能使突变体的表型得到部分回复“5 。”1 ，而在拟南芥中 异位表达来自百合( j j 删 o n g i f o r u m ) 的缺失M A D S - - b o x 结构域的A P 3 同源 基因L M A D S I 可使转基因植物产生类似a p 3 突变体的花瓣变成类似萼片结构，雄 蕊类似心皮结构的表型。“。一系列的实验证明M A D S b o x 基因的功能在整个被子 植物中是保守的。 2
