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1、实验二十四 牛白血病的诊断目 的初步掌握本病的临诊诊断、，实验室诊断和琼脂凝胶免疫扩散试验。内容及方法一、临诊诊断 本病诊断方法有多种，迄今公认血液学诊断仍是一种较普遍而实用的诊断方法，血液学诊断法进展较快，而且此法能作为早期诊断。 1流行病学 患牛和带毒牛是本病的传染源。被感染的牛大多数为无症状终身带毒 者。健康牛群的发病，多由于引进感染种畜所致，但一般要经过数年(平均4年)才出现肿瘤病例。本病既可通过垂直传播又可通过水平传播。胎内感染和吃病牛初乳而感染，说明垂直传播的重要意义。牛与牛接触通过气源传播。实验证明吸血昆虫(蛆、蜱、蝙蝠等)对传播本病起重要作用。输血、接种疫苗、外科手术(去势、断
2、尾、断角、剪耳号等)均可传递病毒引起感染。也在公牛精液中发现病毒，因此交配感染是可能的。在自然条件下只感染牛，以48岁牛发病最多，3岁以下牛多为散发。将人工培养的病毒接种初生绵羊和犊牛都能感染发病。用于本病毒人工感染的试验动物除绵羊外，尚有山羊、猪、鹿、猕猴、黑猩猩、家兔、蝙蝠、猫和犬。绵羊对本病毒高度敏感，且比牛易形成淋巴肉瘤，是牛白血病病毒感染试验的理想模型。不同品种牛对本病似有易感性，但奶牛的感染率高于其他牛。本病的发生率随年龄增长而呈上升的趋势。据报道本病的发生具有家族史，还认为牛白血病病毒感染的反应主要根据宿主的遗传因素。据国内调查研究证明，我国黑白花奶牛对牛白血病病毒感染，持续性淋
3、巴细胞增生及淋巴肉瘤的发生都有家族史，并提出了多因子遗传的观点。因此病毒、环境因素和遗传因素都应得到同样重视。 2病状 临诊上明显的症状是全身体表淋巴结(如腮、肩前、股前淋巴结等)显著肿大而且坚硬。直肠检查发现腹股沟和髂淋巴结肿大，以及内脏器官有肿瘤肿块，具有特别的诊断意义。经常可发现眶后淋巴结肿大，挤压眼球，使眼球突出。本病的临床类型可分为下列4型。 (1)成年型 多见于2岁以下的奶牛，呈地方流行性，病牛产奶量下降，食欲减退或废绝，消瘦，体表淋巴结肿大，腹泻。有的眼球突出。后期常发生后驱麻痹或瘫痪，吸呼困难，尿不畅，心脏机能障碍。孕牛有的发生流产。 (2)犊牛型(或幼牛型) 6月龄以内的犊牛
4、，呈散发，病犊表现全身性淋巴结肿大、恶病质，心音不整。还发生B细胞免疫缺乏。 (3)胸腺型(或青年期型) 主要发生于618月龄的肉用牛。特征症状为肿瘤体从颈腹侧部一直延伸至胸腔，由于肿瘤压迫呼吸道而表现呼吸困难；肿瘤压迫食道可使嗳气受阻，导致瘤胃臌气。 (4)皮肤型 散发于3岁以上的牛。病牛皮肤出现许多疹块样的病变，后来逐渐形成溃疡或坏死。3病变 病理学诊断意义较大，通过尸体剖检，病理组织学切片检查，可得出本病的正确结论。尸体剖检的特征有肿瘤病变。一般认为牛白血病98属肿瘤型，几乎都是淋巴 细胞型或成淋巴细胞型。体表淋巴结肿大、灰色、切面突起。内脏器官(心、真胃、肝、脾等)有肿瘤结节，其大小差
5、异很大。有的病牛胸腺发生肿瘤。也有淋巴结呈对称性肿大，但无肿瘤形成。少数病牛只有真皮发生结节状白细胞浸润，在病后期出现淋巴结肿大和内脏 肿瘤。组织学检查发现，肿瘤中含有致密基质和两种细胞，一种为淋巴细胞(直径810m)，另一种为成淋巴细胞(直径1215m)，并常见到核分型现象。电镜观察肿瘤细胞， 见到核小囊。二、实验室诊断 (一)病原学检查 1病料采取 生前血液检查可采取新鲜血液(抗凝)。检测血清中特异抗体采取新鲜血 液，分离血清。进行病理组织学检查可采取活体组织或肿瘤组织。制作切片标本，可采取的组织包括淋巴结、心耳、肝、脾、肾、胸腺等。 2直接镜检 将BLV感染牛的淋巴细胞在37培养4872
6、h后，制作超薄切片标本，在电镜下，从细胞的空泡内和细胞膜上发现有很多游离的和正在出芽的乙型病毒颗粒。病毒颗粒多为球形，少数呈棒状，大小不一，平均直径约为100nm(90120nm)，外有双层囊膜，囊膜表面有长1015nm的微细纤突，衣壳直径4090nm。其核酸型为单股RNA。 3分离培养 BLV能感染牛、绵羊、山羊、人、猿、犬和蝙蝠等哺乳动物的细胞。这 些细胞有些为成纤维细胞(如BLJ5)，有些为上皮样细胞(如LFK)，有些为淋巴样细胞(如NBC)。进行细胞培养时，通常须将感染牛的血液淋巴细胞与刚长成单层的上述任何一种细胞共同培养，单层细胞被感染后即形成持续性感染。大多数种类的细胞不表现细胞病
7、变，能释放出完整的病毒颗粒，释放量可能很多。作细胞培养时对感染牛的血液淋巴细胞须经4872h的短期培养，并在培养液中加入植物血凝素(PHA)。 4诱发合胞体试验(SIA) 将病牛淋巴细胞与代谢旺盛的指示细胞(如人双倍体细 胞)共同培养后，经48天出现细胞病变，为晚期多核细胞病变。尚有一种早期多核细胞 病变，即在共同培养24h后开始出现的细胞病变。用于早期多核细胞病变的指示细胞通常 用CC8-1，和F81(小鼠肉瘤病毒转化的猫细胞)。应在F81细胞一定要生长良好，单层不能有 空隙。于37培养23天，逐日观察，在低倍镜下每个视野中都能见到大小不等的合胞体，小者含核十多个，大者含核几十个至上百个。已
8、知BLV在某些细胞中可引起合胞体细胞病变，能被BLV抗血清所抑制，常用于BLV或其抗体检测。评价本试验在检测病牛外周血液淋巴细胞中的BLV，较电镜观察和免疫荧光试验更为敏感和可靠，与琼脂扩散试验的敏感性相一致；但本试验比较麻烦。 (二)琼脂凝胶免疫扩散试验 1材料准备 (1)器材及试剂： 打孔器：内径5mm 琼脂糖：试剂级 (2)抗原 由FLKBLV(持续性感染牛白血病病毒的胎羊肾细胞)细胞培养液经提 取和浓缩制成，是以病毒囊膜糖蛋白(gp)为主，并含髓核蛋白(p)的混合抗原，gp滴度不低于4个单位，试验时与标准阳性血清之间必须在24h内出现清晰的沉淀线，与标准阴性血清之间不得出现任何沉淀线。
9、本抗原以冻干产品供应，用时以蒸馏水溶解，并恢复到原体积(详见使用说明书)。 (3)标准阳性血清 能与标准抗原在24h时内产生明显的细直而致密的一条沉淀线 (gp抗体)，末端接触二侧相邻孔的边缘。 (4)被检血清 按常规方法采血分离血清，保存在4于15天内检查有效。 (5)琼脂糖平板的制备 琼脂糖凝胶的配方： 琼脂糖(试剂级) 1g NaCl(A、R) 85g 1.0硫柳汞(试剂级) lml 磷酸缓冲液(0.05molLpH7.2) 100ml 将上述各种成分混合，加热充分溶解，分装瓶中，塞紧后4保存，使用时融化制板， 有效期两个月。 平板制作：将充分融化的琼脂糖凝1517ml在5060时加到平
10、皿(直径9cm)中， 注意不要产生气泡，凝胶板厚度为2mm，凝固后把平皿倒置，在4冰箱中可保存10天。 2操作方法 (1)琼脂糖平板打孔 首先在坐标纸上画好7孔型和63孔型图案，如图12一I，12一，供选用，孔径5mm，孔距3mm。图案放在乎皿下，用打孔器按图型准确位置打孔，孔内琼脂用针头小心挑出，勿破坏周围琼脂。 (2)滴加抗原和血清 中央孔加抗原(G)，1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6孔分别加三份被检血清。63孔型按图12一，“G”孔加抗原，“+”孔加标准阳性血清，数字孔加被检血清。各孔一次加满，但不准溢出，平皿加盖后放在湿盒中，于室温(20以上)或37温箱内作用，经24h和48h各
11、检查一次，检查时用斜射强光，背景要暗。 3结果判定阳性心根据被检血清中抗体种类和浓度的差别可能出现下列几种结 果。 (1)阳性 出现一条清晰沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线完全融合，少数被检血 清在此沉淀线的外侧(靠近被检血清孔)，还出现粗而直的第二条沉淀线，这是P沉淀线。 (2)强阳性 有沉淀线但较模糊而宽。遇此情况应将被检血清作14倍稀释后重检，应出现清晰沉淀线。 (3)弱阳性 抗原孔和血清孔之间虽无沉淀线，但使两侧标准阳性血清形成的沉淀线 末端向被检血清孔内侧弯曲。 阴性被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线，标准阳性血清形成的沉淀线直伸到被检血清孔的边缘。 可疑标准阳性血清形成的沉淀线末端在被检血清处稍弯。可用7孔型重检，重检仍为可疑时，判为阳性。非特异性反应被检血清虽形成沉淀线，但与标准阳性血清沉淀线的末端不相融合。该血清应判为阴性。 复习题与作业 1简述牛白血病的流行特点、病状和病理变化。2叙述牛白血病病原分离方法与步骤。
